论文部分内容阅读
食用色素是食品添加剂的重要门类,天然蓝色系食用色素资源稀缺。全球对染料的年需求是80万吨,其中蓝色素超过8万吨。我国使用的食品蓝色素主要是“亮蓝”(GB7655.1-2005)和“亮蓝铝色淀”(GB7655.2-2005),美国称为靛蓝素(Indigo tine; FD&C Blue No.2, USA),均属于化学合成色素。靛蓝是一种重要的蓝色系食用色素,目前主要通过化学合成法生产,化学合成靛蓝需要使用苯胺、硝基苯、邻苯二甲酸酐等原料,毒性大、污染环境严重,而天然提取靛蓝来源较少且价格昂贵,因此生物合成靛蓝色素成为近年来天然色素制造的重要研究方向。在前期研究中,分离筛选得到一株具备高产靛蓝色素能力的野生菌株Pseudomonas putida B4。进一步研究发现,该菌在靛蓝色素发酵体系中无靛玉红(indirubrin)生成,具备较强的苯乙烯单加氧酶酶活性。分析认为,该酶可能与P. putida B4的靛蓝色素合成能力密切相关。通过生物信息学分析,确认在野生菌P. putida B4中存在可能具有靛蓝代谢调节作用的苯乙烯单加氧酶基因styAB和苯乙烯氧化物异构酶styC基因。分别构建苯乙烯单加氧酶基因styAB、苯乙烯氧化物异构酶基因styC以及styABC基因过表达工程菌株P. putida B4-01、P. putida B4-02和P. putida B4-03,空载质粒对照菌株P.putida B4-0,以及styAB基因敲除菌P. putida B4-04和styC基因敲除菌P. putida B4-05。通过对野生菌和各基因工程菌株在靛蓝发酵体系中生长曲线、mRNA表达水平、苯乙烯单加氧酶酶活性水平以及靛蓝色素产量等表型进行检测后发现,吲哚在加氧酶催化下进行的加氧反应是靛蓝合成代谢途径的关键节点,styAB基因是P. pwtofa B4中靛蓝色素合成代谢途径中的关键酶基因,其对于靛蓝色素合成和下游styC基因的表达均有重要调节作用。而styAB同styC基因问存在互作效应,styC基因的功能缺失会反向降低styAB基因的表达,且抑制菌体靛蓝色素合成速度和产量。将styAB基因和styABC基因分别进行原核表达,构建得到大肠杆菌基因工程菌E.coli AB和E.coli ABCo对比二者靛蓝色素发酵曲线发现,styAB基因作为靛蓝色素合成操纵子可在原核表达系统中催化靛蓝色素合成,而styC基因的表达对于工程菌靛蓝色素合成能力无显著影响。通过响应面试验对工程菌E.coli AB的靛蓝色素发酵条件进行优化,得到的最适条件为底物浓度0.95mg/mL,发酵温度29℃,起始pH值6.9。在该条件下工程菌E.coli AB的靛蓝产量为67.65mg/mL,与预测值拟合度达99%,说明该优化模型具有良好可靠性,较之野生菌Pseudomonas putida B4的产量提高了约5.7倍。styAB基因上游存在一对二元转录调控因子styS和styR基因。该二元调控系统在菌体内部属于组成表达,而当生长环境中存在诱导物吲哚或苯乙烯时,styS基因受到激发并激活styR的大量表达,进而激活styAB基因的表达。研究表明靛蓝合成操纵子styAB基因属于诱导表达,其表达量与styS和styR的调节作用息息相关。通过构建苹果酸酶基因maeB基因过表达工程菌得到辅酶因子NADH再生增强体系。在NADH再生增强体系下,靛蓝色素合成能力较之野生菌提高约20%,而其中styAB基因的表达、苯乙烯单加氧酶酶活水平也相应提高。与之相对应的是,当styAB基因过量表达时,工程菌P. putida B4-01山maeB基因表达水平和苹果酸酶活性也有一定程度的增加。这说明辅酶因子NADH和靛蓝色素操纵了styAB之问存在协同调控作用。论文依据不同基因过表达菌株和基因敲除菌株在表达水平、酶活性水平和靛蓝产物水平上的表型差异,探讨了Pseudomonas putida B4中靛蓝色素合成机制,明确该合成途径的关键酶和关键节点,并研究了靛蓝色素合成操纵子的转录调控模型,阐述了辅酶因了再生体系与靛蓝色素合成代谢途径间的协同调控作用,为靛蓝色素高效发酵体系的构建和工业化推广奠定了理论依据和研究基础。