骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)是来源于骨髓的具有多向分化潜能和旁分泌功能的成体干细胞,在再生修复医学领域具有广阔的应用前景。放射性肠损伤是临床腹部肿瘤放疗过程中最为常见的并发症之一,常导致肠黏膜剥脱和肠屏障功能丧失,并可发展为慢性放射性肠炎。肠隐窝干细胞显著凋亡和增殖抑制是辐射致肠道损伤的主要原因,因此,能否利用骨髓间充质干细胞移植技术,使其向受损肠道定植并分化为肠黏膜上皮细胞,促进肠损伤修复,已成为当前国内外学者关注的研究热点之一。研究表明,体内组织损伤后的局部微环境可能释放一系列的趋化因子,而循环中的骨髓源性干细胞,可在趋化因子及其受体的介导下,向损伤部位靶向迁移并定植,此过程称为“归巢”。电离辐射损伤可诱导组织细胞中一系列基因及蛋白表达增强,其中就包括某些趋化因子。在本课题中,我们首先探讨了外源性MSCs经静脉移植后向放射损伤肠道归巢并横向分化的潜能,以及趋化因子在放射损伤小肠组织的表达情况,在此基础上,我们试图通过基因转染技术使MSCs高表达趋化因子受体,从而在受损肠道所表达趋化因子的吸引下,提高MSCs向肠黏膜靶向归巢和横向分化的能力,发挥肠黏膜修复作用,为MSCs治疗放射性肠损伤的临床应用奠定实验基础。全文分为三部分:　　 第一部分 MSCs向放射性损伤肠道归巢及横向分化潜能的研究　　 目的:1.观察外源性MSCs向放射损伤肠道归巢并横向分化的潜能；2.探讨放射损伤小肠组织的趋化性细胞因子表达情况。　　 方法:用密度梯度离心结合贴壁筛选法进行β-Gal转基因小鼠MSCs的体外分离、培养。受体鼠接受单剂量13 Gyγ-射线腹部照射,建立放射性肠损伤模型。供体MSCs经尾静脉移植,于移植后第5、10天杀取受体鼠小肠标本,通过免疫荧光方法检测外源性MSCs在受损肠黏膜的定植情况,并通过RT-PCR和WesternBlot方法检测趋化性细胞因子(fractalkine,MIP-3,IL-8,SDF-1,TECK)在放射损伤小肠组织的表达水平。　　 结果:外源性MSCs可以归巢至放射损伤肠黏膜并横向分化为肠上皮细胞,但定植数量很低(<4％)。RT-PCR和Western Blot检测结果表明,基质细胞衍生因子-1(SDF-1)的表达水平在肠道放射损伤后明显上调。　　 结论:1.外源性MSCs具有归巢并横向分化为肠上皮细胞的潜能；2.放射性肠损伤后,趋化因子SDF-1的表达水平上调。　　 第二部分 CXCR4重组腺病毒表达载体构建并转染MSCs　　 目的:1.构建CXCR4重组腺病毒表达载体并转染MSCs:2.观察MSCs转染后目的基因的表达情况。　　 方法:将目的基因CXCR4克隆至穿梭质粒pShuttle-IRES-hrGFP,构建成pShuttle-CXCR4。经PmeⅠ酶切线性化后,电穿孔转化含有骨架质粒pAdeasy的感受态细菌E.coli BJ5183,实现细胞内同源重组。PacⅠ酶切线性化重组质粒,转染HEK293A细胞,包装为感染性病毒颗粒(Ad-CXCR4),病毒液经PCR鉴定后,反复扩增3次,CsCl梯度离心纯化,最后用 TCID50法(Tissue Cluture InfectionDose50)进行病毒滴度测定。重组腺病毒以MOI=100转染第三代MSCs,荧光显微镜下观察感染效率,噻唑蓝(MTT)法绘制细胞生长曲线,利用细胞免疫组化和Western Blot方法观察MSCs转染后目的基因的表达情况。　　 结果:应用AdEasyTM载体系统成功构建了携带CXCR4基因的重组腺病毒。重组体在HEK293A细胞包装为感染性病毒,PCR鉴定正确,经大量扩增并纯化后,最终得到6.3×1010pfu／mL的高滴度病毒液。Ad-CXCR4以MOI=100转染MSCs后的感染效率约为80％,未出现细胞病理反应(CPE),细胞生长曲线显示转染对MSCs增殖能力无明显影响。细胞免疫组化和Western Blot检测结果证明,转染后的MSCs高表达目的基因CXCR4。　　 结论:1.应用 AdEasyTM载体系统成功构建了携带CXCR4基因的重组腺病毒；2.重组腺病毒转染后的MSCs高表达目的基因CXCR4。　　 第三部分 CXCR4-MSCs移植对放射性肠黏膜损伤的修复作用　　 目的:1.观察CXCR4-MSCs移植后向放射性损伤肠道的归巢能力；2.研究CXCR4-MSCs移植对放射性肠黏膜损伤的修复作用。　　 方法:受体鼠接受13 Gyγ-射线腹部照射后,经尾静脉注射MSCs,实验分为3组:A组(生理盐水组):注射生理盐水；B组(Null-MSCs移植组):注射Ad-Null(空载体)转染的MSCs；C组(CXCR4-MSCs移植组):注射经Ad-CXCR4转染的MSCs。于移植后第5、10天杀取受体鼠小肠标本,通过免疫荧光法检测MSCs向受损肠黏膜的定植情况,测定肠绒毛高度和隐窝深度、肠黏膜损伤评分以及血清D-乳酸、DAO水平,以评价MSCs移植对受损小肠组织形态学和肠黏膜通透性的影响。　　 结果:C组的MSCs肠黏膜定植数量明显高于B组(P<0.01),C组的肠黏膜损伤评分、血清D-乳酸和DAO水平较A组和B组显著下降,而肠绒毛高度和隐窝深度得到明显改善(P<0.01)。　　 结论:1.CXCR4基因修饰可显著提高MSCs向肠道归巢定植和分化的能力；2.CXCR4-MSCs移植促进了放射性肠损伤的修复。