近年来,超分辨荧光成像技术的快速发展革新了生物学研究方法,因为它通过突破传统荧光显微镜的光学衍射极限,实现了超高的分辨率。超分辨成像技术的建立依赖于高性能的荧光染料,而其中的定位型超分辨成像对染料要求更高,染料分子需具备在时空中稀疏的光转换能力。作为适用于定位型超分辨成像的核心染料,罗丹明染料被广泛应用于超分辨成像研究,然而该染料的关键性质仍然表现不理想。为此,有必要通过理性的分子设计为完成高质量超分辨成像开发基于罗丹明的荧光染料。荧光染料在定位型超分辨成像中的适用性可以通过分析其单分子光物理性质来加以预测和评价,为此本论文首先解决单分子分析算法开发的关键问题,建立了一种单分子分析算法。该算法由三部分构成:(1)单分子的识别,通过超分辨定位和分子聚类的方法排除在空间上重叠的单分子信号;(2)状态轨迹的拟合,采用隐匿Markov模型分析亮暗态;(3)单分子光物理性质的测量,给出每种单分子性质的物理定义。基于Matlab将上述算法转换为具有图形化界面的软件,自动化分析的单分子光物理性质特征,为准确评价单分子光物理性质提供重要工具。罗丹明螺内酰亚胺具备可逆光激活特征,可以实现稀疏发光的控制,适用于光激活定位显微成像。然而,其关键的亮态时间性质目前仍有待于优化。本论文提出通过构建分子内酸性环境来延长该类染料亮态时长的策略,通过将羧基引入邻近螺环位置构建了新型罗丹明螺内酰亚胺Rh-Gly。光激活、pKa证实了新策略对罗丹明螺内酰亚胺亮态的稳定性;对基于该策略染料及其类似物应用上述单分子分析算法和软件实现了单分子光物理性质计算和测量,分析结果显示邻接羧基将螺内酰亚胺的亮态时间从～30ms延长至～60 ms,并预期该策略染料具备良好的超分辨成像性能。通过基于该策略的Rh-Gly染料及其标记功能性探针,实现了 10 s时间分辨率和～50 nm空间分辨率的活细胞线粒体超分辨成像,以及对活细胞细胞核H2B蛋白和固定细胞微管超分辨成像。其次,为了改善传统四甲基罗丹明(TMR)在水溶液中不理想的发光效率,本论文开发了一种季铵化哌嗪策略来抑制TICT态的形成,提升罗丹明染料的亮度,提高其超分辨成像能力。光谱实验结果表明季铵化哌嗪取代的罗丹明MPR(Φ=0.93;ε=8.7 × 104 L×mol-1×cm-1)相比于TMR(Φ=0.47;ε=7.8 × 104 L×mol-1×cm-1)显示出大于两倍的亮度提升。通过建立的单分子分析方法对MPR和TMR的单分子光物理性质统计,其结果显示MPR具有更好的单分子亮度且预测其定位型超分辨成像能力更优。通过对基于该策略标记衍生物的开发,实现了对固定细胞的微管以及活细胞的细胞膜和溶酶体的超分辨成像。本论文发展的两种罗丹明染料分子优化策略为开发适用于超分辨成像的染料提供了平台分子,促进未来超分辨成像技术的发展和进化。