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研究背景： 淋巴水肿(Lymphedema)是一种由于淋巴转运能力降低引起组织间隙淋巴液潴留，从而出现局部组织肿胀的慢性进行性疾病。淋巴水肿根据病因分为原发性和继发性，原发性淋巴水肿是由于遗传等原因导致先天性淋巴脉管系统受损所引起的，继发性淋巴水肿是由于手术、肿瘤放化疗、丝虫感染等损伤淋巴管所引起的。淋巴水肿的传统治疗方式包括烘绑疗法、手法淋巴引流、吸脂术等，这些治疗方法在一定程度上缓解了症状，限制了疾病的进展，但是并不能完全修复淋巴管的损伤。 近年来组织工程技术的发展，为淋巴水肿的治疗提供了新思路。通过细胞移植的方法促进淋巴管的新生、重建淋巴循环或许可以成功治疗淋巴水肿。间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)由于其多向分化的潜能，且具有低毒性、广谱性、可自体移植，多用于多种传统治疗方法疗效较差的疾病。而骨髓间充质干细胞(Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)由于取材容易、较易分离和在体外广泛增殖的能力使其成为组织工程的最佳候选细胞。 BMSCs可以在一定条件下被诱导分化得到淋巴管内皮细胞(Lymphatic Endothelial Cells,LECs),为淋巴管生成提供了种子细胞。在BMSCs向LECs分化的过程中，血管内皮生长因子C(Vascular EndothelialGrowthFactorC,VEGF-C)起到核心作用，可以说是一种必须因子。血管内皮生长因子受体3(VascularEndothelialGrowthFactor Receptor3,VEGFR-3)作为VEGF-C的配体，与VEGF-C的结合能加速淋巴管生成。整合素cx9(Integrina9)能直接绑定到VEGF-C，有助于VEGF-C介导的淋巴管生成。Integrina9和VEGFR-3均可以作为配体直接结合VEGF-C，发挥相应生理作用，因此在淋巴管生成中可能存在VEGF-C/VEGFR-3和VEGF-C/Integrina9两条信号通路。 碱性成纤维细胞生长因子(BaseFibroblastGrowthFactor,bFGF)具有广泛而强大的生物活性，包括促进细胞的有丝分裂、细胞增殖与细胞分化作用，且它可以作为诱导剂来诱导BMSCs分化为神经样细胞、肝细胞、血管内皮样细胞等。因此我们推断bFGF或许可以成功诱导BMSCs分化为LECs。肝细胞生长因子(HepatocyteGrowth Factor,HGF)可以促进促进各种中胚层和外胚层来源的细胞的增殖，促进上皮和内皮细胞的迁移。本课题组前期研究已证实HGF可以联合VEGF-C通过上调integrina9来诱导BMSCs分化为LECs,说明HGF是一种有效的淋巴管生成因子。 目前对诱导BM SCs向LECs分化这个过程的研究尚处于起步阶段，且尚无确切的诱导分化方案，诱导分化的分子机制尚不明确。本实验利用VEGF-C、bFGF、HGF三种诱导因子的多种组合诱导方式，研究VEGF-C、bFGF、HGF诱导BMSCs向LECs分化的可能性，寻找最优方案，并探索它们完成这个过程的分子机制。为MSCs治疗淋巴水肿提供新思路和实验依据。 第一部分使用bFGF、HGF、VEGF-C诱导BMSCs向LECs分化 目的： 使用bFGF、HGF、VEGF-C作为诱导剂，通过不同组合的诱导方案来诱导BMSCs分化，观察细胞形态的变化、检测LECs标志分子的表达，探索更为髙效的诱导方法，探索淋巴管新生的分子机制，为临床应用MSCs治疗淋巴水肿提供实验依据。 方法： 1)流式细胞仪检测BMSCs表面特征性抗原的表达； 2)取第3代BMSCs随机分为8组：空白对照组、VEGF-C诱导组、HGF诱导组、bFGF诱导组、VEGF-C联合HGF诱导组、VEGF-C联合bFGF诱导组、HGF联合bFGF诱导组、VEGF-C联合HGF、bFGF诱导组，培养10d，倒置相差显微镜下观察细胞形态的变化； 3)免疫印迹试验(Western Blot,WB)和实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR,RT-qPCR)检测LECs标志性分子淋巴管内皮透明质酸受体-1(Lymphatic Vessel Endothelial Hyaluronic Acid Receptor1,LYVE-1)、VEGFR-3,integrina9的相对表达量。 结果： 1)BMSCs表达CD90、CD44,不表达CD34; 2)BMSCs呈长梭形、成纤维细胞样，经VEGF-C诱导组后细胞逐渐变圆变短，呈多边形状。 3)空白对照组、bFGF单独、HGF单独、HGF联合bFGF诱导组均不表达LECs标志性分子；VEGF-C联合HGF、bFGF诱导组表达最强；VEGF-C联合HGF诱导组与VEGF-C联合bFGF诱导组相比，LYVE-1表达几乎无差别(Pwestem=0.208，Ppcr=0.511),integrina9的表达前者明显髙于后者(Pwestem=0.002，PPCr=0.002),VEGFR-3的表达前者明显低于后者(PWestem=0.000，PPCR=0.000)。 结论： 1)使用VEGF-C+bFGF+HGF的诱导方法可能是本实验中诱导BMSCs向LECs分化的效率最高的方案； 2)bFGF及HGF不能单独诱导BMSCs的分化，只能辅助VEGF-C来诱导BMSCs分化为LECs; 3)HGF可能是通过刺激VEGF-C/Integrina9信号通路来促进分化的；bFGF可能是通过上调VEGFR-3的表达，活化VEGF-C/VEGFR-3信号通路来促进分化的。 第二部分bFGF及HGF在诱导分化中的相互作用 目的： 使用VEGF-C作为基础诱导剂，bFGF、HGF作为辅助诱导剂共同诱导BMSCs分化，并改变bFGF、HGF加样顺序及加样间隔时间，通过检测LECs标志分子的表达来判断诱导成功与否，通过检测VEGFR-3、integrina9的表达量来研究bFGF及HGF的相互联系。 方法： 1)取第3代BMSCs随机分为4组：空白对照组；VEGF-C联合HGF+bFGF诱导组（先加入HGF、VEGF-C,6h后再加入bFGF)；VEGF-C联合bFGF+HGF诱导组（先加入bFGF、VEGF-C,6h后再加入HGF)；同时加入HGF、bFGF、VEGF-C组。连续培养10d，在倒置相差显微镜下观察细胞形态的变化。 2)分别设置12h、24h的时间间隔，重复以上操作。 3)WB检测各组LYVE-1、VEGFR-3及integrina9的蛋白表达量。 结果： 1)空白对照组均不表达LYVE-1、VEGFR-3及integrina9。 2)在时间间隔相同的前提下，LYVE-1、VEGFR-3及integrina9在其余3个实验组中均阳性表达，且表达量无明显差异(P＞0.05)。 3)改变加入HGF和bFGF的时间间隔后，LYVE-1、VEGFR-3及integrina9在3个实验组中均阳性表达，且表达量仍然无明显差异(P＞0.05)。 结论 在VEGF-C存在的前提下，HGF和bFGF在诱导BMSCs向LECs分化的过程中的作用不分先后顺序。这表明在诱导分化的过程中，HGF和bFGF的作用可能是相互独立的。