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目的:针对PD-1分子为代表的免疫检查点阻断剂的肿瘤治疗取得了前所未有的成功，相较于传统的化放疗，免疫检查点的治疗无论在反应率和治疗效果都有较大的提升。然而，在肿瘤浸润性特异性细胞毒性CD8+T细胞上调表达PD-1的机制一直没有得到很好的解析。同时，针对PD-1的抗体治疗往往需要面对耐受及肿瘤复发的问题，这更加凸显了进一步阐释PD-1上调机制的重要性。另一方面，越来越多的证据表明，肿瘤再生细胞在介导肿瘤免疫逃逸的过程中发挥重要作用，但具体机制有待进一步的论证。同时，当今学术界对于PD-1上调机制研究往往集中于T细胞受体(TCR)介导的相关信号通路，具体表现为PD-1的表达受到NFAT2，Notch，STATs等几个与TCR息息相关的转录因子的调控。然而，在肿瘤微环境中，T细胞也受到来自于肿瘤细胞分泌的细胞因子及代谢物的影响，这些信号分子可能绕过TCR，直接对T细胞的PD-1进行调控。本论文拟利用实验室现有的培养肿瘤再生细胞的方法，对肿瘤再生细胞通过自身分泌的信号分子导致CD8+T细胞上调PD-1的机制进行解析，并对进一步完善基于CD8+T细胞的肿瘤免疫治疗提出新的策略。
方法:(1)为了研究肿瘤再生细胞与特异性T细胞之间的相互作用关系，我们首先通过三文鱼软胶培养B16及B16-OVA的肿瘤再生细胞，并在体外活化Pmel及OT-I小鼠来源的CD8+T细胞，将T细胞与普通及肿瘤再生细胞进行共培养，并用Annexin-V及7-AAD检测肿瘤细胞的凋亡，并用PD-1，IFN-γ，TNF-a及CD107a分析T细胞的功能。(2)为了进一步研究肿瘤再生细胞引起T细胞上调PD-1，下调效应分子的机制，我们用共培养后的上清去培养活化的CD8+T细胞，并进一步检测:1.原共培养上清中的各种细胞因子(IFNγ，TNF-a，IL2，IL10);2.活化的CD8+T细胞PD-1，IFNγ，TNF-a、CD107a的表达;同时，为了排除呈递通路的影响，我们也对H-2kb-ova进行的表达进行了分析。(3)为了探究各个细胞因子发挥的作用，我们在共培养体系中加入IFNγ或TNF-a的中和抗体并分析T细胞PD-1的表达，同时并用IFNγ处理普通的肿瘤细胞及肿瘤再生细胞，并用处理后的上清去培养CD8+T细胞，并检测其PD-1的表达。(4)为了探究IFN-γ通过肿瘤细胞引起T细胞PD-1上调的原因，我们检测IFNγ处理肿瘤细胞后胞内Kyn的量，并用Kyn处理T细胞，检测不同量不同处理时间的Kyn对PD-1的改变，为了进一步确证这一结论，我们使用无Trp的培养基来进行共培养实验，并分析肿瘤细胞的凋亡及T细胞各项指标的改变。(5)为了进一步探究IFN-γ引起Kyn增加的原因，我们进一步分析催化Kyn产生的酶的表达，及转运Trp的各个转运子的表达。(6)为了确证IDO1及SLC1A5在肿瘤再生细胞与T细胞相互作用中的功能，我们在共培养体系中加入IDO1及SLC1A5的抑制剂1-MT及GPNA，并分析肿瘤细胞的凋亡及T细胞的功能。(7)为了进一步确证IDO及SLC1A5的功能，我们构建了IDO1与SLC1A5的敲低细胞系，并将敲低细胞系与T细胞进行共培养，分析肿瘤细胞的凋亡及T细胞功能。(8)为了进一步探究Kyn引起T细胞PD-1上调的机制，我们进一步分析其靶点AhR在T细胞中的作用，其中包括AhR在活化的T细胞中的表达，AhR在Kyn处理后的活化情况，及AhR在PD-1上调过程中的作用，并将OT-I中的AhR进行敲低，将其与肿瘤细胞共培养，分析肿瘤细胞的凋亡情况及T细胞的功能状况。(9)为了进一步确证AhR对PD-1的直接调控，我们构建了PD-1的启动子报告载体，并通过荧光强度检测Kyn及AhR对其的调控作用，同时使用AhR的另外一个激动剂TCDD对T细胞进行处理，检测PD-1的表达。(10)为了进一步分析Kyn作用于T细胞的细节，分析在Kyn处理T细胞后，T细胞相关转运子的表达。(11)为了进一步确定Kyn转运子在T细胞功能中的作用，我们使用PAT4及SLC7A8的抑制剂处理T细胞并同时构建了转运子的敲低T细胞，将敲低成功的T细胞用Kyn进行处理或将其与肿瘤细胞进行共培养，分析肿瘤的凋亡及T细胞的功能。(12)为了进一步确定转运子的调控关系，我们使用ChIP-PCR分析Kyn处理后，AhR与PAT4及SLC7A8的结合，并同时使用AhR的抑制剂处理，分析转运子的表达，也构建PAT4及SLC7A8的启动子报告系统，分析AhR对这两个基因的调控。(13)为了区分探究TCR信号引起的PD-1上调与Kyn-AhR信号通路的关系，我们用Kyn处理未激活的T细胞，同时预先使用CD3/28活化T细胞，并用Kyn处理，并检测T细胞PD-1的表达。(14)为了进一步分析TCR信号与Kyn-AhR对PD-1的调控作用，我们使用TCR关键转录因子NFAT2的抑制剂，分析其激活与PAT4及SLC7A8这两个转运子的关系，同时用ChIP-PCR分析NFAT2与PAT4及SLC7A8的结合。(15)为了进一步确定我们所取得的结论，我们同时进行相关体内实验。其中包括:1.对正常小鼠及AhR敲除鼠注射Kyn，并进行T细胞表面PD-1表达的分析，同时，另一组实验注射CD3抗体，分析活化时T细胞PD-1的表达;2.构建荷瘤小鼠，往荷瘤小鼠内注射Kyn或者过继正常或者基因改造的T细胞或者给与AhR抑制剂，继而分析肿瘤内浸润T细胞的功能及动物荷瘤大小改变及生存期。(16)进一步确认该信号通路在人体是否实现，我们进行以下人体实验:1.收集健康人和各型肿瘤病人的外周血及肿瘤，分离其中的T细胞，并进行PD-1的染色，同时，收集血清及肿瘤外周组织及肿瘤组织裂解上清，检测Kyn的浓度。2.收集肿瘤病人的外周血的CD8+T细胞，并用CD3/CD28活化，加入Kyn或者AhR抑制剂处理，检测T细胞PD-1的表达，及相关转运子的表达。3.收集病人外周血中高表达PD-1及低表达PD-1的T细胞并用ChIP-PCR和RT-PCR分析转运子的表达及AhR对转运子的影响。
结果:(1)1.肿瘤再生细胞被特异性CD8+T细胞杀伤时，表现出更低的凋亡;2.CD8+T细胞在与肿瘤再生细胞共培养时，表现出更高的PD-1表达，而T细胞效应性分子包括IFN-γ、TNF-a及CD107a都出现降低。(2)1月中瘤再生细胞与普通肿瘤细胞相比，H-2Kb-OVA的表达并无明显差异;2.共培养上清中IFNγ、TNF-a、IL2、IL10都可以被检测到，其中TNF-a，IFN-γ分泌最多;3.肿瘤再生细胞共培养上清诱导CD8+更高的表达PD-1，同时更低的TNF-a，IFN-γ及CD107a的表达。(3)1.中和了IFNγ可以导致共培养体系中CD8+T细胞表面PD-1表达下降，TNF-a抗体并没有引起PD-1的改变;2.用IFNγ处理肿瘤再生细胞的上清相比普通肿瘤细胞上清导致更高的PD-1的表达。(4)1.IFN-γ处理后的肿瘤再生细胞相较于普通的肿瘤细胞而言，能够产生更多的Kyn;2.用Kyn处理CD8+T细胞能够导致PD-1上调，并且具有时间和计量效应;3.去除培养基中的Trp时，共培养体系中肿瘤再生细胞的凋亡得到了极大的提升，同时，CD8+T细胞PD-1的表达下调，相关效应分子IFNγ、TNF-a及CD107a的表达上调。(5)1.催化Kyn产生的酶IDO1及转运Trp的转运子SLC1A5在本底水平上均比普通的肿瘤细胞表达要高;2.在加入IFNγ处理以后，IDO1与SLC1A5的表达均有大幅度提高。(6)在共培养体系中加入IDO1的抑制剂1-MT或SLC1A5的抑制剂GPNA都可以增加CD8+T细胞对肿瘤再生细胞的杀伤，同时降低T细胞PD-1的表达，增加相关效应分子的分泌。(7)肿瘤再生细胞中的SLC1A5-IDO通路可以导致T细胞上调PD-1，下调相关效应分子的表达，表现出更强的免疫逃逸。(8)1.T细胞的激活导致AhR的蛋白的水平明显上调;2.加入Kyn处理，AhR蛋白水平的进一步上调，同时表现出明显的核转位;3.在使用AhR的抑制剂DMF及Kyn处理T细胞，PD-1的表达被抑制;4.使用敲低了AhR的OT-ICD8+T细胞与肿瘤细胞共培养，肿瘤细胞的凋亡增加，同时T细胞PD-1表达下调，效应分子表达增加。(9)1.Kyn处理增强PD-1启动子的荧光信号;2.TCDD增加T细胞PD-1的表达。(10)Kyn处理CD8+T细胞可以导致T细胞Kyn转运子PAT4、SLC7A8上调表达。(11)1.使用抑制剂或敲低PAT4或SLC7A8时，Kyn进入T细胞受阻，同时AhR的核转位也受到抑制;2.在共培养体系中使用抑制剂或将PAT4或SLC7A8敲低的T细胞与肿瘤细胞共培养，肿瘤细胞的凋亡增多，同时T细胞PD-1的表达下调，同时效应分子的表达增多。(12)1.加入Kyn及AhR抑制剂时，Kyn相关转运子调控作用消失;2.ChIP-PCR表明，Kyn可引起AhR与PAT4与SLC7A8的结合增强;3.Kyn-AhR可以促进PAT4和SLC7A8启动子荧光强度更强。(13)1.Kyn可以导致未活化的T细胞上调表达PD-1;2.Kyn能够引起预先活化的T细胞表达更高的PD-1。(14)1.抑制了NFAT2的活性，PAT4，SLC7A8的表达也会下调;2.通过ChIP-PCR，NFAT2可以结合到PAT4与SLC7A8的启动子，并且随T细胞的活化变强。(15)1.往小鼠体内注射Kyn，可引起T细胞上调表达PD-1，而这一现象在AhR敲除鼠体内消失;2.往小鼠体内注射CD3抗体，正常小鼠相较于AhR敲除鼠而言，体内T细胞活化后有更高的PD-1表达;3.往荷瘤鼠肿瘤内注射Kyn，瘤内浸润的T细胞PD-1表达也会上调;4.往荷瘤小鼠过继PAT4或SLC7A8敲低的T细胞，肿瘤比过继正常T细胞的要更小，同时小鼠的生存期延长;5.往荷瘤鼠瘤内注射AhR抑制剂DMF,瘤内浸润T细胞PD-1大幅下降，同时效应分子IFNγ，TNF-a上调;6.联合过继特异性CD8+T细胞及AhR抑制剂的治疗可以增加T细胞的肿瘤杀伤效果，延长小鼠生存期。(16)1.病人肿瘤内的T细胞相较于外周血的T细胞，表达更高的PD-1;2.肿瘤病人血清中的Kyn浓度，高于正常人的血清，同时瘤内的Kyn浓度高于瘤周健康组织，且对于乳腺癌而言，外周血Kyn的浓度与T细胞PD-1的表达成正比，而对于健康人来说，没有这一相关性;3.用Kyn处理人T细胞，可以上调其PD-1的表达且使用AhR抑制剂可以抵消这一效应，同样的，PAT4及SLC7A8在人T细胞也被Kyn及AhR调控;4.PD-1高表达的T细胞有更高的AhR表达，同时转运子PAT4、SLC7A8也表达更高，另一方面，在PD-1高表达的T细胞，AhR对PD-1、PAT4、SLC7A8的启动子结合更强。
结论:通过以上实验，我们发现，特异性T细胞在杀伤肿瘤细胞时，有一群具有干性的肿瘤难以被杀死。这群具有干性的肿瘤细胞通过上调SLC1A5及IDO1极大地活化自身的Trp代谢通路，产生大量的Kyn到微环境中。外排的Kyn通过T细胞表面的Kyn转运子PAT4及SLC7A8进入T细胞，并活化转录因子AhR，AhR继而结合到PD-1的启动子，上调PD-1的表达，同时也下调效应分子IFNγ，TNF-a，GranzymeB的分泌。通过干预以上代谢物为基础的代谢通路，我们可以增加T细胞的功能，达到更好的控制肿瘤的效果。本研究揭示了IDO1与T细胞功能抑制的直接联系，为提出新的肿瘤免疫治疗策略提供了理论依据。
方法:(1)为了研究肿瘤再生细胞与特异性T细胞之间的相互作用关系，我们首先通过三文鱼软胶培养B16及B16-OVA的肿瘤再生细胞，并在体外活化Pmel及OT-I小鼠来源的CD8+T细胞，将T细胞与普通及肿瘤再生细胞进行共培养，并用Annexin-V及7-AAD检测肿瘤细胞的凋亡，并用PD-1，IFN-γ，TNF-a及CD107a分析T细胞的功能。(2)为了进一步研究肿瘤再生细胞引起T细胞上调PD-1，下调效应分子的机制，我们用共培养后的上清去培养活化的CD8+T细胞，并进一步检测:1.原共培养上清中的各种细胞因子(IFNγ，TNF-a，IL2，IL10);2.活化的CD8+T细胞PD-1，IFNγ，TNF-a、CD107a的表达;同时，为了排除呈递通路的影响，我们也对H-2kb-ova进行的表达进行了分析。(3)为了探究各个细胞因子发挥的作用，我们在共培养体系中加入IFNγ或TNF-a的中和抗体并分析T细胞PD-1的表达，同时并用IFNγ处理普通的肿瘤细胞及肿瘤再生细胞，并用处理后的上清去培养CD8+T细胞，并检测其PD-1的表达。(4)为了探究IFN-γ通过肿瘤细胞引起T细胞PD-1上调的原因，我们检测IFNγ处理肿瘤细胞后胞内Kyn的量，并用Kyn处理T细胞，检测不同量不同处理时间的Kyn对PD-1的改变，为了进一步确证这一结论，我们使用无Trp的培养基来进行共培养实验，并分析肿瘤细胞的凋亡及T细胞各项指标的改变。(5)为了进一步探究IFN-γ引起Kyn增加的原因，我们进一步分析催化Kyn产生的酶的表达，及转运Trp的各个转运子的表达。(6)为了确证IDO1及SLC1A5在肿瘤再生细胞与T细胞相互作用中的功能，我们在共培养体系中加入IDO1及SLC1A5的抑制剂1-MT及GPNA，并分析肿瘤细胞的凋亡及T细胞的功能。(7)为了进一步确证IDO及SLC1A5的功能，我们构建了IDO1与SLC1A5的敲低细胞系，并将敲低细胞系与T细胞进行共培养，分析肿瘤细胞的凋亡及T细胞功能。(8)为了进一步探究Kyn引起T细胞PD-1上调的机制，我们进一步分析其靶点AhR在T细胞中的作用，其中包括AhR在活化的T细胞中的表达，AhR在Kyn处理后的活化情况，及AhR在PD-1上调过程中的作用，并将OT-I中的AhR进行敲低，将其与肿瘤细胞共培养，分析肿瘤细胞的凋亡情况及T细胞的功能状况。(9)为了进一步确证AhR对PD-1的直接调控，我们构建了PD-1的启动子报告载体，并通过荧光强度检测Kyn及AhR对其的调控作用，同时使用AhR的另外一个激动剂TCDD对T细胞进行处理，检测PD-1的表达。(10)为了进一步分析Kyn作用于T细胞的细节，分析在Kyn处理T细胞后，T细胞相关转运子的表达。(11)为了进一步确定Kyn转运子在T细胞功能中的作用，我们使用PAT4及SLC7A8的抑制剂处理T细胞并同时构建了转运子的敲低T细胞，将敲低成功的T细胞用Kyn进行处理或将其与肿瘤细胞进行共培养，分析肿瘤的凋亡及T细胞的功能。(12)为了进一步确定转运子的调控关系，我们使用ChIP-PCR分析Kyn处理后，AhR与PAT4及SLC7A8的结合，并同时使用AhR的抑制剂处理，分析转运子的表达，也构建PAT4及SLC7A8的启动子报告系统，分析AhR对这两个基因的调控。(13)为了区分探究TCR信号引起的PD-1上调与Kyn-AhR信号通路的关系，我们用Kyn处理未激活的T细胞，同时预先使用CD3/28活化T细胞，并用Kyn处理，并检测T细胞PD-1的表达。(14)为了进一步分析TCR信号与Kyn-AhR对PD-1的调控作用，我们使用TCR关键转录因子NFAT2的抑制剂，分析其激活与PAT4及SLC7A8这两个转运子的关系，同时用ChIP-PCR分析NFAT2与PAT4及SLC7A8的结合。(15)为了进一步确定我们所取得的结论，我们同时进行相关体内实验。其中包括:1.对正常小鼠及AhR敲除鼠注射Kyn，并进行T细胞表面PD-1表达的分析，同时，另一组实验注射CD3抗体，分析活化时T细胞PD-1的表达;2.构建荷瘤小鼠，往荷瘤小鼠内注射Kyn或者过继正常或者基因改造的T细胞或者给与AhR抑制剂，继而分析肿瘤内浸润T细胞的功能及动物荷瘤大小改变及生存期。(16)进一步确认该信号通路在人体是否实现，我们进行以下人体实验:1.收集健康人和各型肿瘤病人的外周血及肿瘤，分离其中的T细胞，并进行PD-1的染色，同时，收集血清及肿瘤外周组织及肿瘤组织裂解上清，检测Kyn的浓度。2.收集肿瘤病人的外周血的CD8+T细胞，并用CD3/CD28活化，加入Kyn或者AhR抑制剂处理，检测T细胞PD-1的表达，及相关转运子的表达。3.收集病人外周血中高表达PD-1及低表达PD-1的T细胞并用ChIP-PCR和RT-PCR分析转运子的表达及AhR对转运子的影响。
结果:(1)1.肿瘤再生细胞被特异性CD8+T细胞杀伤时，表现出更低的凋亡;2.CD8+T细胞在与肿瘤再生细胞共培养时，表现出更高的PD-1表达，而T细胞效应性分子包括IFN-γ、TNF-a及CD107a都出现降低。(2)1月中瘤再生细胞与普通肿瘤细胞相比，H-2Kb-OVA的表达并无明显差异;2.共培养上清中IFNγ、TNF-a、IL2、IL10都可以被检测到，其中TNF-a，IFN-γ分泌最多;3.肿瘤再生细胞共培养上清诱导CD8+更高的表达PD-1，同时更低的TNF-a，IFN-γ及CD107a的表达。(3)1.中和了IFNγ可以导致共培养体系中CD8+T细胞表面PD-1表达下降，TNF-a抗体并没有引起PD-1的改变;2.用IFNγ处理肿瘤再生细胞的上清相比普通肿瘤细胞上清导致更高的PD-1的表达。(4)1.IFN-γ处理后的肿瘤再生细胞相较于普通的肿瘤细胞而言，能够产生更多的Kyn;2.用Kyn处理CD8+T细胞能够导致PD-1上调，并且具有时间和计量效应;3.去除培养基中的Trp时，共培养体系中肿瘤再生细胞的凋亡得到了极大的提升，同时，CD8+T细胞PD-1的表达下调，相关效应分子IFNγ、TNF-a及CD107a的表达上调。(5)1.催化Kyn产生的酶IDO1及转运Trp的转运子SLC1A5在本底水平上均比普通的肿瘤细胞表达要高;2.在加入IFNγ处理以后，IDO1与SLC1A5的表达均有大幅度提高。(6)在共培养体系中加入IDO1的抑制剂1-MT或SLC1A5的抑制剂GPNA都可以增加CD8+T细胞对肿瘤再生细胞的杀伤，同时降低T细胞PD-1的表达，增加相关效应分子的分泌。(7)肿瘤再生细胞中的SLC1A5-IDO通路可以导致T细胞上调PD-1，下调相关效应分子的表达，表现出更强的免疫逃逸。(8)1.T细胞的激活导致AhR的蛋白的水平明显上调;2.加入Kyn处理，AhR蛋白水平的进一步上调，同时表现出明显的核转位;3.在使用AhR的抑制剂DMF及Kyn处理T细胞，PD-1的表达被抑制;4.使用敲低了AhR的OT-ICD8+T细胞与肿瘤细胞共培养，肿瘤细胞的凋亡增加，同时T细胞PD-1表达下调，效应分子表达增加。(9)1.Kyn处理增强PD-1启动子的荧光信号;2.TCDD增加T细胞PD-1的表达。(10)Kyn处理CD8+T细胞可以导致T细胞Kyn转运子PAT4、SLC7A8上调表达。(11)1.使用抑制剂或敲低PAT4或SLC7A8时，Kyn进入T细胞受阻，同时AhR的核转位也受到抑制;2.在共培养体系中使用抑制剂或将PAT4或SLC7A8敲低的T细胞与肿瘤细胞共培养，肿瘤细胞的凋亡增多，同时T细胞PD-1的表达下调，同时效应分子的表达增多。(12)1.加入Kyn及AhR抑制剂时，Kyn相关转运子调控作用消失;2.ChIP-PCR表明，Kyn可引起AhR与PAT4与SLC7A8的结合增强;3.Kyn-AhR可以促进PAT4和SLC7A8启动子荧光强度更强。(13)1.Kyn可以导致未活化的T细胞上调表达PD-1;2.Kyn能够引起预先活化的T细胞表达更高的PD-1。(14)1.抑制了NFAT2的活性，PAT4，SLC7A8的表达也会下调;2.通过ChIP-PCR，NFAT2可以结合到PAT4与SLC7A8的启动子，并且随T细胞的活化变强。(15)1.往小鼠体内注射Kyn，可引起T细胞上调表达PD-1，而这一现象在AhR敲除鼠体内消失;2.往小鼠体内注射CD3抗体，正常小鼠相较于AhR敲除鼠而言，体内T细胞活化后有更高的PD-1表达;3.往荷瘤鼠肿瘤内注射Kyn，瘤内浸润的T细胞PD-1表达也会上调;4.往荷瘤小鼠过继PAT4或SLC7A8敲低的T细胞，肿瘤比过继正常T细胞的要更小，同时小鼠的生存期延长;5.往荷瘤鼠瘤内注射AhR抑制剂DMF,瘤内浸润T细胞PD-1大幅下降，同时效应分子IFNγ，TNF-a上调;6.联合过继特异性CD8+T细胞及AhR抑制剂的治疗可以增加T细胞的肿瘤杀伤效果，延长小鼠生存期。(16)1.病人肿瘤内的T细胞相较于外周血的T细胞，表达更高的PD-1;2.肿瘤病人血清中的Kyn浓度，高于正常人的血清，同时瘤内的Kyn浓度高于瘤周健康组织，且对于乳腺癌而言，外周血Kyn的浓度与T细胞PD-1的表达成正比，而对于健康人来说，没有这一相关性;3.用Kyn处理人T细胞，可以上调其PD-1的表达且使用AhR抑制剂可以抵消这一效应，同样的，PAT4及SLC7A8在人T细胞也被Kyn及AhR调控;4.PD-1高表达的T细胞有更高的AhR表达，同时转运子PAT4、SLC7A8也表达更高，另一方面，在PD-1高表达的T细胞，AhR对PD-1、PAT4、SLC7A8的启动子结合更强。
结论:通过以上实验，我们发现，特异性T细胞在杀伤肿瘤细胞时，有一群具有干性的肿瘤难以被杀死。这群具有干性的肿瘤细胞通过上调SLC1A5及IDO1极大地活化自身的Trp代谢通路，产生大量的Kyn到微环境中。外排的Kyn通过T细胞表面的Kyn转运子PAT4及SLC7A8进入T细胞，并活化转录因子AhR，AhR继而结合到PD-1的启动子，上调PD-1的表达，同时也下调效应分子IFNγ，TNF-a，GranzymeB的分泌。通过干预以上代谢物为基础的代谢通路，我们可以增加T细胞的功能，达到更好的控制肿瘤的效果。本研究揭示了IDO1与T细胞功能抑制的直接联系，为提出新的肿瘤免疫治疗策略提供了理论依据。