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两栖动物的生殖内分泌系统对环境中的内分泌干扰物(EDCs)具有较高的敏感性,其中非洲爪蛙的性腺分化发育对环境雌激素敏感,而黑斑蛙对环境雄激素敏感。因此,它们可以作为研究环境雌激素和环境雄激素的实验动物。三氯生(TCS)作为一种大量使用的抗菌剂在环境中普遍存在。体外研究显示TCS可能具有雌/抗雌激素活性和雄激素活性,但相应的体内数据缺乏,且存在不一致的结果。为此,本论文以非洲爪蛙和黑斑蛙为实验动物分别检测了TCS的雌/抗雌激素效应和雄激素效应,发展了相应的研究内分泌干扰物的技术方法。具体研究如下: 1.应用非洲爪蛙检测TCS的雌/抗雌激素效应。研究了TCS单独暴露和与炔雌醇(EE2)共暴露对爪蛙性腺分化发育的影响。结果发现:TCS单独暴露对非洲爪蛙的性腺形态学和组织学以及性别比例没有明显影响,但是300 nmol/LTCS上调了雌性高表达的基因CYP19和Foxl2的表达水平,并且下调了SOX9b的表达,这些作用与EE2类似,显示TCS可能具有较弱的雌激素效应;与EE2共暴露时,300 nmol/L TCS抑制了EE2诱导的基因雄性的雌性化程度,完全雌性化比率从66.7%降至42.3%,显示TCS在雌激素存在时具有抗雌激素效应。 2.应用黑斑蛙检测TCS的雄激素效应。以1 nmol/L双氢睾酮(DHT)为阳性对照,研究了3、30、300 nmol/L TCS对黑斑蛙性腺分化发育的影响。结果发现:TCS暴露导致7.8%的个体出现性腺形态学和组织学的异常,3和300 nmol/LTCS改变了黑斑蛙的性别比例,但是没有雄性或者雌性偏向,TCS还影响了性二态基因的表达。由此认为,TCS对黑斑蛙的性腺分化发育有一定干扰作用,但是因为无法确定黑斑蛙的基因性别,还不能判断TCS的干扰作用是雄性化效应还是雌性化效应。 3.筛选黑斑蛙雌雄特异基因。从哺乳动物的性染色体基因中筛选到36个候选基因,然后进行PCR扩增,筛选在黑斑蛙雌性或雄性中特异性存在的基因。结果仅得到8个基因的扩增产物,凝胶电泳和进一步测序分析,没有发现雌雄差异的基因。 综上,本论文发现了TCS单独暴露对非洲爪蛙可能具有较弱的雌激素效应,但当与EE2共暴露时,TCS表现出了一定的抗雌激素效应;发现了TCS对黑斑蛙的性腺发育有较弱的干扰作用,但是无法确定TCS具有雄激素效应;探索了性二态性分子等分子指标,发展了使用两栖动物研究内分泌干扰物的技术方法。