目的：　　 青光眼是继白内障之后的第二大致盲性眼病,严重影响人类的健康,原发性开角型青光眼(POAG)是青光眼的主要类型之一,但至今发病机制不清楚。随着近几年分子遗传学的发展,目前倾向于遗传因素是其主要的病因之一。Optineurin是原发性开角型青光眼确定的2个致病基因之一,主要表达在眼后节,但具体致病机制不清。视网膜神经节细胞是青光眼致病的靶细胞,但是目前很少关于Optineurin对视网膜神经节细胞的影响的研究。本实验主要是将OptineurinsiRNA转染进PC12细胞及RGC-5细胞,并且通过这种方法来探讨Optineurin在POAG发病中的分子生物学机制。　　 实验方法：　　 设计并建造了4个干扰质粒,并利用lipofectamine2000转染到PC12细胞中,通过Quantitative real-time PCR,Western blot挑选鉴定出干扰率最高的质粒,用作下面的实验。利用干扰效率最高的质粒用作于PC12稳定转染细胞株的建立。并且用Western blot来鉴定稳定转染细胞株Optineurin的蛋白表达量,同时用荧光倒置显微镜来观察稳定转染细胞。通过MTT来检测质粒稳定转染的PCI2细胞培养24h、48h、72h的细胞增殖和存活情况,通过流式细胞学检测细胞培养48h后的凋亡情况。　　 将稳定转染细胞的总RNA提出,并进行纯化。用基因芯片技术来找出目的基因干扰后发生变化的基因。将基因差异倍数超过2倍的基因找出,并且按照基因作用进行分类,整理出同基因凋亡和增殖相关的基因。最后锁定同POAG发病可能相关的基因。并且通过Quantitative real-time PCR进行鉴定。　　 将干扰效果最佳的质粒转染进RGC-5细胞中,并且用Western blot进行鉴定此质粒在RGC-5细胞中的干扰效果。通过透射电镜观察质粒干扰后细胞超微结构的变化。通过MTT检测质粒转染24h、48h、72h后细胞的增殖情况,并且通过流式细胞学检测质粒转染48h后细胞的凋亡情况。用western blot检测干扰后可能相关基因的蛋白表达情况。　　 实验结果：　　 在建造的4个质粒中,siOptn-3的干扰效果最佳,其干扰率可以达到80％以上。利用siOptn-3进行稳定转染PC12细胞,发现Optineurin的蛋白表达量稳定转染细胞组是未转染细胞组蛋白表达量的20％以下。而且稳定转染细胞株的细胞增殖明显低于正常未转染质粒组和阴性对照组。流式细胞学结果显示稳定转染细胞组的细胞凋亡率明显高于正常没有转染质粒的细胞组和阴性对照组。　　 利用生物芯片技术,筛选出Optineurin干扰后表达量发生变化的差异基因。根据上诉实验的结果,将差异基因按照功能进行了分类,挑选出同细胞生长和凋亡相关的基因。最后再将这些差异基因变化倍数超过2倍的挑选出来,一共找出这样的基因109个,作为日后研究使用。从这些基因中发现了一些神经保护因子和轴突运输因子。他们对神经元细胞的增殖和凋亡都有很重要的影响。最后我们选出Snap25、Nef1、Bdnf、Ntf3用Q-Real time-PCR对稳转的PC12细胞进行再一次的确定。我们发现Optineurin干扰后的PC12稳定转染细胞相对于没有转染质粒的细胞组Bdnf为57.52％(p＜0.05),Ntf3为78.09％(p＜0.05),Snap25为36.40％(1)＜0.05)和Nef1为55.66％(p＜0.05)。　　 实验证实,sihOptn-3对RGC-5细胞Optineurin的表达有很好的抑制作用,Western blot证实,Optineurin的干扰率可达80％以上。我们对干扰后的细胞进行了电镜观察,发现干扰后的细胞,核膜与胞膜出现溶解,粗面内质网扩张,线粒体减少,染色质边集,出现凋亡小体。而阴性对照组没有出现上诉表现。我们用MTT检测干扰后细胞增殖的情况,发现干扰后细胞在24h、48h、72h都出现明显的细胞增殖的抑制现象。流式细胞学关于凋亡的检测结果显示,细胞被干扰后48h,细胞的凋亡率明显高于阴性对照组和正常细胞对照组。而用Western blot检测Snap25、Nef1、Bdnf,、Ntf3发现质粒转染组相对于没有质粒转染的细胞空白对照组结果是,空白对照组Bdnf.Ntf3,Snap25,Nef1分别是实验组的2.06倍,1.28倍,3.119倍,Nef12.16倍。　　 结论：　　 Optineurin对PC12细胞和视网膜神经节细胞的生长和凋亡起到调控作用,Optineurin参与了神经细胞的轴突运输,它影响Snap25和Nef1的表达,同时通过调节神经保护因子Bdaf、Ntf3来影响细胞的增殖与凋亡。由此可以推断,Optineurin可能是通过影响上述途径在POAG发病过程中发生作用,导致POAG的发生。