研究背景:结直肠癌在我国所有恶性肿瘤发病率和死亡率中分别排名第3位和第5位,并且随着生活水平的提高,我国结直肠癌的发病率和死亡率呈上升趋势。由于早期结直肠癌缺少特异性症状,大多数结直肠癌患者就医时已处于肿瘤中晚期,5年生存率低于10%。因此高灵敏度、特异性的早期诊断方法对于降低结直肠癌死亡率意义重大。粪隐血试验、结肠镜或乙状结肠镜检查是目前最常用的筛查方法,前者灵敏度、特异性较低,结肠镜或乙状结肠镜因其侵入性,患者接受度和依从性较低。因此,更多学者将目光转向以开发高准确率、无创性筛查的分子标志物的研究。DNA甲基化是由酶诱导的可遗传的化学修饰,抑癌基因的异常DNA甲基化使其表达下调,这种机制在肿瘤发生发展过程更为频繁的影响基因表达,因此DNA甲基化更可能具有作为肿瘤生物标记的潜力,以实现高灵敏度和特异性肿瘤筛查。Li H等利用甲基化芯片对配对结直肠癌和癌旁组织进行全基因组扫描,覆盖基因4010个,发现211个基因共297个CpG二核苷酸在癌组织中出现甲基化现象。对发现的候选基因在配对结直肠癌组织中进行验证,发现3个新的基因(PHOX2B,FGF12和GAD2)甲基化至少有四个探针阳性。对比高度甲基化基因PHOX2B,FGF12和GAD2与已知的结直肠癌甲基化基因Vimentin和SEPT9的甲基化水平,发现PHOX2B,FGF12和GAD2区分癌与非癌组织的能力要明显优于Vimentin和SEPT9。揭示了将这3个基因甲基化检测用于结直肠癌早期诊断的潜在可能性。本研究选取其中一个基因GAD2在人群中进行甲基化验证,以评估其成为筛查结直肠癌肿瘤标志物的可能。目的:探究改良的粪便脱落细胞富集方法的粪便脱落细胞富集效率;评价粪便脱落细胞GAD2基因启动子甲基化对早期结直肠癌的诊断价值。方法:对2015年10月至2016年6月至陆军总医院消化内镜中心行全结肠镜检查的结直肠癌高危人群,采用改良富集方法富集其清肠导泻液中的脱落细胞,对结肠镜检查发现高危腺瘤或结直肠癌的患者,钳取肿瘤和肿瘤旁组织。分别提取配对的粪便脱落细胞悬液、肿瘤组织、肿瘤旁组织的DNA,实时定量PCR检测标本中管家基因表达(β-actin),评价改良的粪便脱落细胞富集法有效率;采用甲基化特异性PCR的方法验证GAD2基因启动子甲基化在粪便脱落细胞中阳性表达率,计算粪便脱落细胞GAD2甲基化作为结直肠癌筛查方法的灵敏度和特异度。结果:93例样本粪便脱落细胞富集后管家基因β-actin阳性率为95.7%;高危腺瘤、结直肠癌Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期、正常人β-actin表达阳性率分别为95.7%、85.7%、100%、100%、100%、95.7%;GAD2基因启动子甲基化在肿瘤组织表达阳性率为76.6%,而在非肿瘤组织表达阳性率为17.0%;GAD2基因启动子甲基化在Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期的粪便脱落细胞样本的甲基化阳性率则为58.3%、75.0%、76.5%、100.0%,对所有的结直肠癌,GAD2基因启动子甲基化诊断灵敏度为73.3%,特异性为95.5%。结论:改良的粪便脱落细胞富集方法脱落细胞的富集效率高,可为进一步行分子生物学检测提供基础。粪便脱落细胞中GAD2基因甲基化检测对早期结直肠癌具有一定的诊断意义。