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随着水母爆发日益频繁与人类涉海活动的逐渐增多,有毒水母蜇伤已成为最常见的海洋生物伤,水母蜇伤患者可出现多种局部或全身症状。研究表明水母毒素是一类结构新颖的肽类,具有溶血、心血管、肝肾、神经和皮肤坏死等多种生物活性,其中溶血活性,即损伤红细胞的效应,是水母毒素中普遍存在的一类生物活性。水母种类不同,其毒素的溶血机制亦有所区别,目前关于水母毒素的溶血机制主要有孔道形成和酶活性两种假说。我们推测,水母在亿万年的进化过程中还可能形成其他“高效、直接”发挥毒性的方式,本文第一部分旨在探索孔道形成之外,脂质过氧化损伤在发形霞水母(Cyanea capillata)触手提取物(tentacle extract, TE)产生溶血过程中的作用。水母蜇伤患者可分三种情况:极少数中毒非常严重,出现急性心衰而快速死亡;大多数患者中毒较轻,以蜇伤部位皮肤炎症为主,只需局部处理;另有一部分患者中毒程度介于前两者之间,可出现迟发的多器官功能损伤而需要住院治疗。本课题组前期研究表明,中等剂量TE可以引起动物延迟性的多器官损伤,而肾脏(尤其是肾小管)的急性损伤可能是TE致大鼠延迟死亡的主要原因。因此本文第二部分重点研究TE对肾小管上皮细胞(NRK-52E)的损伤机制。受溶血机制研究结果的启发,TE对NRK-52E细胞的损伤按照“脂质过氧化—活性氧—线粒体—细胞凋亡”的思路来展开。方法第一部分:TE致红细胞损伤(溶血活性)机制研究首先,以0.45%红细胞悬液为受试对象检测TE溶血活性的剂量效应关系,并检测Ca2+和Ca2+通道阻断剂地尔硫卓、维拉帕米、硝苯地平对TE溶血活性的影响。利用共聚焦显微镜观察TE作用后红细胞内Ca2+浓度的变化,并观察Ca2+通道阻断剂地尔硫卓的干预效应。通过系列PEG渗透保护实验,研究孔道形成在TE溶血活性机制中的作用。将抗氧化剂预先与红细胞孵育,检测Vc和GSH对TE溶血活性的影响。通过检测TE作用后红细胞MDA水平,分析TE对红细胞的脂质过氧化损伤效应,并在整体动物中,检测抗氧化剂Vc对TE引起的体内溶血和电解质紊乱的影响。第二部分:TE致NRK-52E细胞损伤机制初探利用MTT法检测不同浓度TE不同作用时间对NRK-52E细胞活力的影响,并在显微镜下观察细胞形态学变化。采用Annexin V-FITC/PI双染,流式细胞仪检测TE作用后细胞凋亡与坏死情况。利用荧光探针DCFH-DA标记技术观察TE作用后细胞内ROS水平,用TBA比色法检测细胞MDA水平,Rhodamine123染色检测线粒体膜电位的变化。结果第一部分:TE致红细胞损伤(溶血活性)机制研究TE对0.45%红细胞悬液产生的溶血效应具有剂量依赖性,产生50%溶血时TE浓度约为150μg/ml。Ca2+能增强TE的溶血活性,而三种Ca2+通道阻断剂均能不同程度抑制TE的溶血活性。TE作用后,红细胞内Ca2+明显升高,而Ca2+通道阻断剂地尔硫卓可以部分拮抗TE作用后红细胞内Ca2+升高的幅度。平均分子量超过4000的PEG可以抑制TE产生的溶血效应。TE作用后红细胞MDA水平随TE剂量依赖性升高,且抗氧化剂Vc和GSH均可以显著拮抗TE的溶血活性;在体内,Vc也可以降低TE引起的溶血程度以及血清中K+和Lac升高的幅度。第二部分:TE致NRK-52E细胞损伤机制初探TE对NRK-52E细胞活力的影响具有剂量和时间依赖性,TE作用后细胞形态发生改变,不再贴壁生长。随TE浓度增大,凋亡和坏死的细胞增多。TE作用后,NRK-52E细胞胞内ROS与MDA水平升高、线粒体膜电位降低。结论除了孔道形成之外,通过脂质过氧化损伤红细胞产生溶血也是TE可能的溶血机制;抗氧化剂Vc可以在体内和体外两个层面抑制TE的溶血活性,可以作为预防和治疗水母蜇伤的候选药物。通过损伤粒体,导致线粒体膜电位降低,胞内活性氧堆积,进而介导细胞凋亡与坏死是TE产生NRK-52E细胞毒性的机制之一。