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大豆(Glycine max(L.) Merr)是世界上主要的粮食和油料作物,是人类食物中植物蛋白质的主要来源。根是植物长期适应陆地生活而在进化过程中逐渐形成的器官,构成植物体的地下部分,根的主要作用是固定植物体,并从土壤里吸收水分和无机盐,提供地上部分生长所需要的养分。一些不良的自然条件如干旱,水涝,盐害等等都与植物的根有着密切的关系,而且大豆的根具有固氮作用。所以根特异表达基因的研究不仅对植物的生长发育过程以及大豆逆境基因工程育种有着重要的利用价值,也为抗病抗虫基因工程、发育调控、固氮等多方面提供更丰富的理论资料。
本研究的主要内容有:
(1)通过比较基因组学和生物信息学的方法,以苜蓿类受体蛋白激酶(RLKs)基因Srlk的序列作为种子序列,在大豆基因组数据库搜索同源性高的基因片段,命名为GmRLK1。苜蓿的基因Srlk已经被证实是与逆境胁迫条件有关的基因,Genebank中的Blast分析表明,GmRLK1与其的同源性序列高达80.0%,对基因GmRLK1序列结构特征、蛋白结构进行了预测分析,结果显示基因GmRLK1编码的蛋白具有植物类受体蛋白激酶结构域,进一步发现它是具有富含亮氨酸重复序列的植物蛋白激酶(LRR-RLK)结构域特征的基因。对大豆基因GmRLK1进行组织表达分析,半定量RT-PCR分析结果表明这个基因主要在根中表达,在茎和叶的表达水平较低。本实验构建大豆富含亮氨酸重复序列类受体蛋白激酶基因GmRLK1的RNA干扰表达载体pB7GWIWG2(Ⅱ)-GmRLK1。
(2)选用大豆无菌苗,苗龄为5-7d为外植体。以无菌苗的子叶、子叶节、下胚轴、幼叶为外植体,分别考察了外植体、培养基、预培养时间等不同理化因素对大豆品种Jack毛状根诱导率的影响。得出了Jack品种最佳诱导条件:MS培养基,预培养2d,K599菌液摇床震荡30 min,AS100μM/L,子叶节为外植体时诱导率最高,可到达92.50%。
(3)用发根农杆菌介导法向大豆根系导入GmRLK1基因,通过壮观霉素,PCR和RT-PCR的筛选得到转基因的大豆发状根。大豆GmRLK1基因转化根进行初步的耐盐性分析,在100 mmol/L NaCl胁迫下,试验结果表明置于MS固体培养基的转基因离体发状根的长度均大于对照,也就初步说明了GmRLK1基因功能可能是与盐胁迫有关。