论文部分内容阅读
三峡库区消落带（Hydro-fluctuation belt）是因三峡水库水位周期性涨落形成的水陆交错地带。长期反季节性水淹引起库区植被受损、植物多样性减少、水土流失等一系列问题,严重影响库区生态环境、居民生活及社会经济可持续发展。桑树作为三峡库区的土著植物,不仅具有较强的抗涝耐旱能力,且兼具经济价值,是修复库区受损植被的优选树种。然而,库区周期性水涝降低了桑树存活率,且存活的桑树长势差异较大,严重阻碍了利用桑树进行生态修复的速度。植物根际促生菌（Plant growth promoting rhizobacteria,PGPR）可通过分泌植物激素、合成抗菌肽、诱导植物系统抗性等途径,促进植物生长及增强宿主植物抗病抗逆潜能。因此,利用根际促生菌提升桑树的抗涝能力,提高桑树成活率,有利于利用桑树修复消落带受损生态系统。论文研究首先检测了实验室前期保存的根际促生菌Klebiella variicola HWS1菌株的生物安全性,及其在桑苗中的定植能力,并从基因组学的层面,初步分析其提升桑树抗涝能力的可能机制;进而构建透明颤菌血红蛋白（VHb）的Klebiella variicola HWS1工程菌株,并评估其对桑树抗水涝胁迫能力的影响。论文研究有利于利用PGPR提升桑树的抗涝能力,为库区消落带植被修复提供新视野及新策略。本研究主要取得了以下结果:1.K.variicola HWS1安全性及定植能力研究使用1×10~7CFU/m L的菌体重悬液均匀涂抹桑叶,晾干后喂食家蚕,家蚕生长状况及生产指标测定结果表明,K.variicola HWS1对家蚕生长、蚕茧重、茧层重、蛹重等,均无不利影响;使用1×10~9CFU/m L的菌悬液对无特定病原体（SPF）级昆明鼠进行灌胃,14天后对小鼠的脏器指数及血常规等指标进行检测,K.variicola HWS1对小鼠生长发育无负面影响。以上结果说明K.variicola HWS1是一株安全性较高的根际促生细菌。利用p GFP4412质粒转化K.variicola HWS1菌株,成功获得K.variicola HWS1/GFP标记菌株。进而利用1×10~7 CFU/m L的K.variicola HWS1/GFP菌株菌悬液对桑苗进行灌根处理,定期观察K.variicola HWS1/GFP的定植情况。结果表明,菌悬液处理1天后,K.variicola HWS1/GFP菌株主要在桑苗根系分布,菌悬液处理3天后,在桑苗根中观察到大量标记菌株,在桑苗茎和叶中亦有少量的标记菌体存在,菌悬液处理7天后,在桑苗的根部、茎髓部、叶片中均能观察到大量的标记菌株,结果表明K.variicola HWS1可以在桑树体内定植。此外,K.variicola HWS1/GFP标记菌株可以在24 h内快速定植在拟南芥中。上述结果说明,K.variicola HWS1具有较强的定植能力。2.K.variicola HWS1基因组测序及其提高植物抗涝能力的研究K.variicola HWS1基因组大小为5,519,472 bp,无内生质粒,K.variicola HWS1基因组含有5050个完整的编码序列（CDS）,利用COG数据库对编码5050个CDS进行注释,发现K.variicola HWS1具有ACC脱氨酶、固氮酶、溶磷、铁载体、蛋白酶合成相关基因,设计引物并成功扩增获得相关功能基因。基因注释及功能基因测序的结果,表明K.variicola HWS1具有潜在的促生及抗逆的潜能。K.variicola HWS1基因组注释结果表明其具有完整的ACC脱氨酶序列,进而本研究利用Red同源重组和酶切连接的方法,分别构建得到了ACC脱氨酶敲除株系（K.variicola HWS1-ΔACC）和ACC脱氨酶的超表达株系（K.variicola HWS1-OEACC）。进一步利用温室盆栽实验,模拟库区消落带水涝胁迫,评估K.variicola HWS1-ΔACC和K.variicola HWS1-OEACC菌株对模式植物拟南芥的水涝胁迫耐受性。结果发现,利用K.variicola HWS1-ΔACC处理后,拟南芥对水涝胁迫的耐受能力与清水对照组无显著差异;而接种了K.variicola HWS1-OEACC和K.variicola HWS1的拟南芥,相较于清水对照组,其生物量分别提高了70%和41%,总叶绿素含量分别提高34%和28%,总氮含量分别提高了32%和27%。此外,K.variicola HWS1-ΔACC处理的拟南芥生长恢复情况与清水对照组相似;ACC脱氨酶超表达菌株和K.variicola HWS1处理的拟南芥,相较于清水对照组,其恢复后的整株重分别提高了80%和57%,总叶绿素含量分别提高了26%和22%,总氮含量分别提高了22%和19%,且ACC脱氨酶超表菌株和K.variicola HWS1处理的拟南芥其存活率相较于对照组分别提高了64%和50%。以上结果表明,K.variicola HWS1和K.variicola HWS1-OEACC菌株处理的拟南芥其对水涝胁迫的耐受能力显著高于清水对照组,而K.variicola HWS1-ΔACC处理的拟南芥与清水对照组无显著差异,表明K.variicola HWS1可通过合成ACC脱氨酶提高植物对水涝胁迫的耐受能力。3.K.variicola HWS1-VHb表达菌株的构建及其对桑树抗水涝胁迫能力的研究由于K.variicola HWS1和K.variicola HWS1-OEACC处理后的拟南芥各项指标无显著差异（P＞0.05）,本章探索将具有提升植物抗逆潜力的外源透明颤菌血红蛋白编码基因（vgb）转入到K.variicola HWS1中,成功获得K.variicola HWS1-VHb,进而通过模拟库区不同程度水涝胁迫（无水淹、根淹、没顶水淹）,评估K.variicola HWS1-VHb对桑苗抗水涝胁迫能力的影响。结果表明,K.variicola HWS1-VHb和K.variicola HWS1处理组桑苗,对水涝胁迫的耐受能力要显著优于清水对照组。桑苗根淹时,其可溶性糖含量分别提高112%和48%,没顶水淹时分别提高164%和60%。桑苗丙二醛（MDA）含量在根淹时分别减少30%和20%,没顶水淹时分别降低37%和25%。此外,K.variicola HWS1-VHb和K.variicola HWS1处理组桑苗在根淹条件下,超氧化物歧化酶（SOD）分别提高467%和296%,过氧化物酶（POD）分别提高323%和245%;桑苗没顶水淹条件下,较清水组桑苗而言,K.variicola HWS1-VHb和K.variicola HWS1处理组桑苗的SOD分别提高141%和42%,POD分别提高174%和78%。在水涝胁迫期间,对桑根系细胞完整程度进行组化染色,结果表明K.variicola HWS1-VHb和K.variicola HWS1处理组的桑苗,其根系完整程度要优于清水对照组,且在根淹条件下,根系投影面积较清水组分别提高63.9%和61.7%,须根数目增加55%和43%;没顶水淹条件下,桑根系面积分别提高36%和12%,须根数目增加55%和43%。水涝胁迫后的恢复期间,K.variicola HWS1-VHb和K.variicola HWS1处理组的桑苗的恢复速度要优于清水对照组,在根淹条件下其新生成的生物量相较于对照组分别提高了164%和92%,在没顶水淹条件下分别提高了164%和53%;在根淹条件下其存活率分别提高了97%和39%,在没顶水淹条件下存活率分别提高了106%和48%。以上结果表明,K.variicola HWS1-VHb和K.variicola HWS1有助于提高桑苗对水涝胁迫的耐受能力及水涝胁迫后的恢复能力,且相较于K.variicola HWS1,K.variicola HWS1-VHb的效果更强。综上,论文研究结果表明K.variicola HWS1菌株具有安全性较高、定植能力强的特点,其合成的ACC脱氨酶可在一定程度上提高植物对水涝胁迫的耐受能力,表达透明颤菌血红蛋白的K.variicola HWS1-VHb工程菌株可以显著提升桑树对水涝胁迫的抗性。论文研究取得的结果可为后续三峡库区消落带生态修复提供策略,亦为其它受损生态系统修复提供参考依据。