论文部分内容阅读
背景:刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种专性有核细胞内寄生的原虫,弓形虫的垂直传播则严重危害人类的健康和畜牧业的生产。它可以感染绝大部分的温血动物。已知弓形虫可以经过胎盘垂直传播给胎儿导致流产,尤其在孕期的前三个月感染容易引起流产。近年发现,部分抗体阳性的孕妇以及感染的实验动物流产的胎盘组织中难以检测到虫体或者弓形虫DNA。由此我们推测,免疫机制可能是弓形虫感染导致流产等不良妊娠结局的部分原因。弓形虫毒力分子具有基因型相关的多态性,I/III型虫株的ROP16驱动巨噬细胞向M2（alternatively activated macrophages,M2）方向极化,而II型虫株GRA15驱动巨噬细胞向M1（classic activated macrophages,M1）方向极化,这两个效应分子的多态性则诱导宿主迥异的免疫应答。与欧美等流行的弓形虫虫株的基因型不同,我国的弓形虫优势基因型为Chinese1虫株,WH3兼具I/III型ROP16I/III和II型GRA15II的多态性,其诱导母-胎界面的免疫失衡致流产可能具有独特的致病机制。相关研究至今尚未见报告。最近研究表明,弓形虫感染导致的不良妊娠结局,其可能的机制为Th17的上调和Tregs的减少。同样,Th1/Th2型免疫平衡决定了免疫应答结果。Th1型免疫偏移可介导对滋养细胞的损伤,导致不良妊娠结局;Th2型免疫偏移介导特异性免疫耐受,则是妊娠的前提和标志。大量研究表明,ROP16I/III诱导Mφ向M2极化,而GRA15II可以诱导Mφ向M1方向极化,并且诱导Th1/Th17和NK细胞的活化。本研究通过CRISPR/Cas9技术构建ROP16I/III基因缺陷虫株WH3Δrop16,探讨携带有gra15II为背景的弓形虫通过颠覆母胎界面免疫平衡从而导致不良妊娠结局的机制。目的:研究以gra15II为背景的Chinese1型虫株WH3Δrop16,模拟II型虫株导致不良妊娠结局的免疫偏移情况,探讨我国流行的优势基因型导致不良妊娠结局的机制。方法:运用CRISPR-Cas9技术构建ROP16I/III基因缺陷虫株WH3Δrop16,利用PCR和Western blotting鉴定单克隆化筛选虫株。吉姆萨染色比较WH3 WT株和WH3Δrop16株在HFF-1细胞中的增殖和入侵情况。同时将两组虫株计数1000个速殖子腹腔注射C57BL/6小鼠,观察小鼠的生死存亡率。再将WH3 WT株和WH3Δrop16株分别感染小鼠腹腔巨噬细胞与原代胎盘滋养层细胞共培养,并设置正常对照组。通过qPCR及ELISA法检测其向M1方向极化指标（NO,iNOS和TNF-α）。同时通过流式细胞术检测胎盘滋养层细胞的凋亡情况。运用C57BL/6小鼠构建孕鼠模型,在孕8天分别注射无菌PBS（正常对照组）、WH3WT株、WH3Δrop16株。感染后第6天无痛麻醉下处死小鼠,观察胎盘、胎鼠的情况及对胎盘组织进行组织病理检查,称量胎盘、胎鼠重量并记录,计算活胎数以及吸收率;再通过流式细胞术、qPCR及ELISA等方法分别检测脾脏及胎盘的Th1（IFN-γ、IL-12）/Th2（IL-4）/Th17（IL-17A）细胞因子的免疫偏移情况,以及Tregs（CD4+CD25+FoxP3）细胞的数量变化和其分泌的IL-10、TGF-β1表达情况。结果:通过PCR和Western blotting鉴定结果显示,成功运用CRISPR-Cas9技术构建ROP16I/III基因缺陷虫株WH3Δrop16,吉姆萨染色后计数表明,WH3 WT株感染单个细胞内的速殖子数均显著高于WH3Δrop16株（p<0.05）。WH3 WT株和WH3Δrop16株两组虫株感染小鼠后,小鼠在感染的12天内均全部死亡,但两组虫株致小鼠的生死存亡率差异无显著统计学意义。同时,与WH3 WT组相比,WH3Δrop16株感染小鼠腹腔巨噬细胞的NO,iNOS和TNF-α产生明显升高。感染WH3Δrop16组的胎盘滋养层细胞的凋亡率明显高于WH3 WT组。与正常对照组相比,感染弓形虫WH3 WT株和WH3Δrop16株均不同程度地引起不良妊娠结局。与感染WH3 WT组相比,感染WH3Δrop16株的孕鼠胎儿、胎盘重量明显下降,胎盘出血、组织坏死情况更加严重、流产率明显升高。与正常对照组相比,感染两组虫株的Th1、Th17细胞因子的表达均升高,其中感染WH3Δrop16株升高更加明显。然而与正常对照组相比,Th2的表达则降低,Tregs细胞的数量明显减少,其分泌的IL-10、TGF-β1的表达明显下降,其中感染WH3Δrop16株降低则更加明显。结论:本次实验成功构建了chinese1型虫株ROP16I/III基因缺陷虫株WH3Δrop16,通过毒力实验结果显示,ROP16基因并不是WH3虫株的毒力效应分子。WH3Δrop16株以gra15II为背景,模拟II型虫株（例如PRU或ME49）,感染孕鼠导致不良妊娠结局,可能机制为GRA15Ⅱ为优势背景的WH3Δrop16株诱导的母体免疫应答,干扰了母胎界面免疫耐受的平衡,导致Th17被激活以及免疫向Th1方向偏移,揭示了Chinese 1型虫株携带的GRA15Ⅱ可能是导致不良妊娠结局的虫源性效应分子。