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蛋鸡产蛋性能受多种因素影响,其中产蛋后期卵巢衰老和卵泡数量减少是导致其产蛋率下降的主要原因。褪黑素对保护卵泡正常发育具有重要意义,mTOR信号通路在调节细胞生长和增殖中发挥重要作用,因此,本项目结合多组学、荧光定量PCR和Western Blot等技术,对褪黑素-mTOR信号通路-卵巢机能这一调控通路进行系统研究,探讨褪黑素和mTOR通路相关基因在蛋鸡卵巢衰老过程中的表达变化规律,解析mTOR信号通路介导褪黑素延缓产蛋后期蛋鸡卵巢衰老的分子机制,为深入研究卵泡等级化建立和延长蛋鸡利用周期提供理论依据。选取30周龄和70周龄的大午金凤蛋鸡各30只,连续5周追踪记录产蛋率和蛋品质,用ELISA方法检测抗氧化及免疫指标,HE染色检测不同发育阶段卵泡的组织结构的变化,利用荧光定量PCR技术检测mTOR信号通路相关基因(CLIP-170、GRB10、LIPIN-1、ULK1、4E-BPS、S6K、PKC、RHO、SGK1)在产蛋高峰期(35周龄)和产蛋后期(75周龄)的不同发育阶段的卵泡中的相对表达水平,利用Western Blot检测关键蛋白(mTOR、PKC、4EBP1)的表达水平。结果表明:与35周龄蛋鸡相比,75周龄蛋鸡产蛋率,抗氧化指标SOD、GSH-Px、T-AOC和免疫球蛋白IgM、IgG的水平极显著降低(P<0.01),MDA水平极显著升高(P<0.01)。75周龄不同等级的卵泡数目小于35周龄,且大白卵泡、小白卵泡、初级卵泡数目与35周龄相比达到极显著水平(P<0.01)。产蛋后期蛋鸡的SWF,LWF,SYF和POF的颗粒细胞层,膜层和结缔层与产蛋高峰期相比极显著降低(P<0.01)。与35周龄蛋鸡相比,75周龄蛋鸡mTOR信号通路下游基因CLIP-1 70、GRB10、LIPIN-1、4E-BP1、S6K、RHO和SGK的mRNA表达量在SWF,LWF,F1,F3和卵巢的表达水平显著降低(P<0.05),在SYF卵泡的mRNA表达水平显著升高(P<0.05)。而75周龄蛋鸡ULK1基因在SWF、LWF、F3、F1及卵巢的mRNA表达量与35周龄蛋鸡相比极显著增加(P<0.01),SYF显著下降(P<0.05)。结果表明mTOR信号通路基因表达模式具有年龄特异性。试验选取60只蛋鸡(70周龄),随机分为2组:对照组和褪黑素组,褪黑素组连续28d腹腔内注射褪黑素,剂量为20mg/kg·d。结果表明褪黑素处理显著增加了血浆中超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化能力(T-AOC)(P<0.01)、免疫球蛋白(IgA,IgG和IgM)(P<0.05)以及生殖激素雌二醇(E2)和促黄体生成素(LH)的水平(P<0.01),同时增加了中白卵泡和小白卵泡的数量(P<0.05),且降低血浆中的活性氧(ROS)水平(P<0.01)。褪黑素组中mTOR,4E结合蛋白-1(4E-BP1)和核糖体蛋白6激酶(S6K)的mRNA表达极显著上调(P<0.01),且褪黑素组中mTOR、p-mTOR蛋白以及mTORC1下游蛋白4E-BP1和p-4E-BP1蛋白水平显著上调(P<0.05)。以上研究表明,褪黑素可以通过增加抗氧化酶和生殖激素的水平以及激活产蛋后期蛋鸡中的mTOR信号通路来促进卵泡生长。试验选用褪黑素处理(200umol/L)与不处理的蛋鸡卵泡颗粒细胞作为研究对象,进行转录组测序分析。测序结果共筛选出581个差异表达基因,与对照组相比,褪黑素处理的蛋鸡卵泡颗粒细胞中有259个基因上调,322个基因下调。对差异基因进行GO富集分析后发现差异表达基因主要涉及细胞增殖与凋亡等生物过程。KEGG分析显示主要聚集在mTOR信号通路,PI3K-Akt信号通路,Foxo信号通路,MAPK信号通路等。实时荧光定量PCR检测差异表达基因,发现与转录组结果一致。筛选出的差异表达基因GRB10,SGK1,PRKCA,RPS6KA2,RAF1,PIK3R3,WNT16 在 mTOR信号通路中调控细胞的生理功能,筛选出的差异表达基因CDKAlA,STAR,IL1B,BOK,FAT,BMP5,AIFM3,PAWR,Foxol参与调控卵泡的增殖和凋亡。表明mTOR信号通路参与褪黑素介导的蛋鸡卵泡颗粒细胞增殖的调控,褪黑素可能通过PI3K-Akt-mTOR级联信号通路发挥调控作用。试验选用小黄卵泡(直径8-10mm)作为研究对象,分离颗粒细胞,将蛋鸡卵泡颗粒细胞与褪黑素(0、2、20或200 umol/L)共同培养48h。结果表明,褪黑素可通过上调Cyclin D1(P<0.01)、Bcl-2(P<0.01)和下调P21、Caspase-3、Beclinl和LC3-Ⅱ(P<0.01)来增强20umol/L和200umol/L颗粒细胞的增殖并抑制其凋亡(P<0.05)。褪黑素处理增加了mTOR,PKC,4E-BP1,S6K的mRNA(P<0.05)和p-TOR,p-S6K蛋白的表达。在细胞中添加mTOR激活剂和抑制剂,并筛选出最佳剂量(10umol/L MHY1485和100nM雷帕霉素),与20umol/L褪黑素联合培养用于后续实验。结果发现与对照组相比,20umol/L褪黑素+10umol/LMHY1485联合培养,颗粒细胞增殖显著增强(P<0.05);100nM雷帕霉素显著抑制颗粒细胞增殖并增强颗粒细胞凋亡(P<0.05),但在20umol/L褪黑素+100nM雷帕霉素联合处理组中,该作用被逆转(P<0.05)。Cyclin D1,Bcl-2蛋白上调和P21,Caspase-3,Beclinl,LC3-II蛋白的下调也验证了这一结果(P<0.05)。20umol/L褪黑素+10umol/LMHY1485激活了mTOR信号通路上游基因PI3K,AKT1,AKT2和下游基因PKC,4E-BP1,S6K(P<0.05)的mRNA表达以及p-TOR,p-S6K的蛋白表达。雷帕霉素显著抑制mTOR信号通路相关基因的mRNA水平(P<0.05)。这些结果最终表明,褪黑素通过激活mTOR信号通路来调节鸡颗粒细胞增殖和抗凋亡的过程。综上所述,研究结果表明,褪黑素通过mTOR信号通路抑制了蛋鸡卵泡颗粒细胞凋亡,增强了机体抗氧化性能,延缓产蛋后期蛋鸡卵巢的衰老。本试验为进一步深入了解蛋鸡卵巢机能衰减机制,延长蛋鸡产蛋周期提供了科学依据。