目的:1.研究碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌耐药分子特征及高毒力株流行情况。2.研究高毒力克雷伯菌碳青霉烯酶基因、PMQR基因、外膜蛋白Omp K36等相关耐药机制,并分析其与毒力特征之间的关系。3.研究碳青霉烯类耐药高毒力肺炎克雷伯菌基因组学及分子进化机制。4.研究高毒力肺炎克雷伯菌碳青霉烯类耐药发展分子机制及对毒力影响。方法:1.收集南昌大学第一附属医院2014年1月至2018年12月期间住院患者各类标本中分离的肺炎克雷伯菌1055株,并通过药敏试验结果筛选出CR-KP菌株。参考文献设计引物,采用PCR及测序筛选出hv KP菌及CR-hv KP菌株,分析菌株的临床信息及耐药基因携带情况。比较药敏数据的差异,并通过PCR及Southern blot明确碳青霉烯酶种类及流行特征,采用PFGE及MLST分析菌株的亲缘性,采用质粒接合试验确认碳青霉烯酶质粒转移能力。2.从第一部分菌株中筛选出部分CR-hv KP菌株分析其碳青霉烯酶质粒携带情况,采用PCR检测毒力基因及耐药基因,PFGE、MLST及wzi分型分析CR-hv KP菌的亲缘性,并采用Southern blot对碳青霉烯酶基因及毒力基因进行定位;筛选部分菌株对其外膜蛋白Omp K36基因进行亚型确定,分析不同亚型菌株的耐药性及毒力的差异性。通过抗中性粒细胞吞噬试验、血清抗性试验、结晶紫法测定其生物膜形成能力,以及体外感染小鼠的半数致死率的结果来反映其毒力;筛选出一部分K1-hv KP菌株,PCR及测序检测PMQR基因、gyr A及par C基因,PFGE分析K1-hv KP菌株亲缘性及与PMQR携带的关系,并分析PMQR基因与毒力基因之间的关系。3.对第一、二部分中筛选出来的三株有代表性的CR-hv KP菌株进行分析,并对其中两株进行全基因组测序,分析其毒力质粒和耐药质粒基因组学,并与已经完成测序的菌株基因组进行比较及亲缘性分析,并通过抗中性粒细胞吞噬试验、血清抗性试验、结晶紫法测定其生物膜形成能力,以及体外感染小鼠的半数致死率的结果来反映其毒力。并从基因组学的角度探究CR-hv KP菌株分子进化的可能机制。4.选择一株筛选出来的hv KP菌野生株BD2411,通过质粒转化将碳青霉烯酶质粒导入至hv KP菌野生株中形成Tfp NDM-hv KP菌株,并通过基因组学和转录组学对碳青霉烯酶质粒导入前后进行比较分析,明确碳青霉酶质粒导入前后hv KP菌基因表达谱的差异性,并通过通过抗中性粒细胞吞噬试验、血清抗性试验、结晶紫法测定其生物膜形成能力,以及体外感染小鼠的半数致死率的结果来反映其碳青霉烯酶质粒导入前后hv KP菌毒力变化。结果:1.我院五年来CR-KP菌的分离率高达24.93%,而CR-hv KP菌占CR-KP菌的15.97%。CR-hv KP菌对阿米卡星、妥布霉素、庆大霉素等氨基糖苷类抗生素的耐药率显著低于CR-KP菌（P<0.05）,但对哌拉西林/他唑巴坦的耐药率则显著高于CR-KP菌（P<0.05）。我院CR-KP菌以携带bla KPC-2基因为主,占71.1%,但也存在bla NDM-1,bla NDM-5,bla NDM-7及bla IMP-4基因的流行。其中产NDM-1酶的CR-KP菌主要流行于烧伤病区,多表现出高水平碳青霉烯类抗生素耐药（MIC>32μg/ml）,以来自创面分泌物为主,多发生于II°以上烧伤患者,部分菌株可通过质粒接合进行碳青霉烯类耐药传播,接合率高达44.44%。Southern blot显示bla NDM-1基因位于一大小约46Kb的Inc X3型质粒上。ST11型和ST17型为产NDM-1酶CR-KP菌主要流行克隆株,且多存在Omp K36基因的缺失或表达量下降。在CR-hv KP菌中有35株表现为拉丝阳性,荚膜血清分型中亦存在K1、K2、K5、K57等高毒力荚膜血清型,88.1%的患者处于感染状态,死亡率更是高达47.6%。2.从第一部分中筛选出来的35株CR-hv KP菌以携带bla KPC-2基因为主,仅2株携带bla NDM基因,且大部分菌株携带ESBL及PMQR相关耐药基因,此外,CR-hv KP菌多携带rmp A、iro N、rmp A2、aerobactin、wca G等多种毒力基因,以ST11为主,占85.7%,但也存在ST23、ST65等高毒力ST分型,PFGE显示共分5个型别,其中A型占85.71%。CR-hv KP菌携带的质粒数量显著高于CS-hv KP菌株,Southern blot显示26株CR-hv KP菌同时携带bla KPC-2质粒和p LVPK-like毒力质粒,此外,我们还首次发现3株CR-hv KP菌携带毒力基因和耐药基因共存的质粒。鉴于Omp K36蛋白在毒力和耐药上兼具双重功能,我们对80株血流感染肺炎克雷伯菌进行Omp K36基因分型,共分A、B、C、D四型,分别占42.5%,7.5%,32.5%,和15%。Omp K36 C型菌毒力基因rmp A、iro B、rmp A2、aerobactin、all S携带率显著高于非C型菌株。21.25%菌株表现出高黏性,其中C型菌株高黏阳性率显著高于非C型菌株（50%vs 7.4%,P<0.001）,48.75%菌株为肝脓肿相关荚膜血清型,包括K1、K54、K20等。此外,C型菌株耐药率显著低于非C型菌株,尤其在bla KPC-2基因阳性率上,而在临床因素上,Omp K36 C型菌感染患者主要以社区获得性血流感染为主（46.2%vs.11.1%,P=0.0002）,多无基础疾病（46.2%vs.7.4%,P<0.0001）。在菌株毒力上,Omp K36 C型菌株血清抗性、抗中性粒细胞吞噬能力上显著高于非C型菌株（P=0.0195和<0.001）,而在生物膜形成上则无显著差异（P=0.1348）。另外,我们还对hv KP菌PMQR基因研究发现,51.42%K1-hv KP菌株携带有PMQR相关基因,以qnr S1为主,其中14.3%菌株同时携带有ESBL基因,PMQR携带K1-hv KP菌株以ST23型为主,但也存在ST11、ST700及ST25等克隆株。3.从第一、二部分中我们筛选出3株有代表性的CR-hv KP菌株（Kp1500、NUHL24835、NUHL30457）。CR-hv KP菌Kp1500是由一株ST11型c KP菌株携带p LVPK-like毒力质粒形成,表现出血清抗性和抗中性粒细胞吞噬能力,LD50仅为1.2×102cfu/ml,并携带含bla KPC-2的Tn4401转座子结构的耐药质粒。CR-hv KP菌NUHL24835则由一株hv KP菌携带NDM-5碳青霉烯酶质粒发展而来,基因组测序显示其携带一Inc X3型耐药质粒,虽缺乏p LVPK-like毒力质粒,但却携带含毒力致病因子的ICEKp1移动元件,表现出血清抗性、低LD50等高毒力特征。CR-hv KP菌NUHL30457则是一株ST65型K2-hv KP菌携带碳青霉烯酶质粒和p LVPK-like毒力质粒而形成,基因组测序显示其携带三个耐药质粒（p30547-2,p30547-3,和p30547-4）和一个毒力质粒（p30547-1）。其中p30547-4质粒为Inc N复制子分型,主要携带bla NDM-1和qnr S1基因,质粒p30547-3为Inc FII（K）复制子分型,主要携带bla CTX-M-65,bla TEM-1,和bla KPC-2基因。而质粒p30547-1为Inc HIB复制子分型,携带多种毒力基因,也与目前hv KP菌株携带p LVPK-like毒力质粒高度同源。此外,NUHL30457表现出血清抗性、抗中性粒细胞吞噬及低LD50等高毒力的特点。在同源性上,CR-hv KP菌与c KP菌及hv KP菌之间存在交叉性。4.以hv KP菌野生株BD2411为受体,将NDM-5碳青霉烯酶质粒导入后形成CR-hv KP菌株。尽管其适应性代价增加和血清抗性能力降低,但菌株仍保持高黏性、抗中性粒细胞吞噬及低LD50等高毒力表型特征。基因组测序未发现明显基因组信息变化,而RNA-seq结果显示质粒导入后107个基因表达上调,576个基因表达下调,采用RT-PCR对转录组中差异表达基因进行验证,发现RT-PCR结果与转录组学结果一致。表达上调的基因主要为糖代谢相关基因和多重耐药外排系统基因,而表达下调的基因则主要为CPS合成和毒力基因。其中下调的CPS合成基因集中于KP1₃714-26基因簇,以KP1₃714（wzc/ptk）,KP1₃718（wzb/tyrosine kinase）,KP1₃720（wza/capsule polysaccharide export protein）,和KP1₃726（orf/glycosyltransferases）基因表达下降明显,而毒力基因多集中在p LVPK-like毒力质粒上,以yad A（-11.25）和iut A（-10.17）基因表达下降最显著。结论:1.本地区CR-KP菌以产KPC酶为主,但也存在NDM及IMP酶的流行。产NDM酶联合外膜蛋白Omp K36的缺失或表达下降是烧伤病区CR-KP菌碳青霉烯类高水平耐药的主要原因。CR-hv KP菌分离率呈上升趋势,且出现高毒力荚膜血清分型,感染患者死亡率高,但对氨基糖类抗生素敏感性较高。2.CR-hv KP菌主要携带bla KPC-2基因,常伴随多种耐药基因,其可携带多种毒力基因,以ST11型为主,携带质粒数量多,常同时携带毒力质粒和耐药质粒,我们还首次在CR-hv KP菌中发现毒力基因和耐药基因共存的质粒。3.血流感染肺炎克雷伯菌可根据Omp K36基因共分四型,其中C型在毒力基因携带、高黏性、高毒力荚膜血清分型、血清抗性及抗中性粒细胞吞噬上显著高于其他非C型,而非C型菌则以耐药为主要特征。4.大部分K1-hv KP菌株可携带有PMQR相关基因,且以qnr S1为主,部分菌株可与ESBL基因共传播。5.首次从基因组学角度分析了CR-hv KP菌株的形成原因,毒力质粒和耐药质粒传递或在CR-hv KP菌株形成中发挥重要作用。6.首次成功通过质粒转化构建CR-hv KP菌株,质粒导入后虽可降低hv KP菌的毒力,但却仍能保持高毒力。质粒导入后可引起hv KP菌糖代谢相关基因及外排泵基因的表达升高,也可引起CPS合成及毒力因子基因表达下降,导致其耐药形成及部分毒力下降。