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在中医理论中,“胸痹”、“心痛”的病理变化过程中均有心血瘀滞。若瘀在头部(脑缺血)则会诱发脑卒中,若瘀在心脏(心肌缺血)则会造成心肌梗死。千百年来,传统中医药在治疗血瘀症导致的心脑血管疾病中取得了很大进展,疗效确切,引人注目,前景广阔。以红花-乳香对药为核心组成的数百方剂在“血瘀证”临床治疗中应用广泛,疗效确切。1665年《外科达成》卷四已将红花-乳香对药命名为“活血定痛汤”,数百年来主治活血祛瘀,行气止痛,二药有“相须”“相使”作用,但红花-乳香活血抗氧化应激损伤“相须”“相使”的作用机制不明。前期,我们在国科金(No.81173514)中,用首创的“药效差示血清色谱法”研究发现,红花和乳香的主要有效成分之中羟基红花黄色素A(HSYA)和11-羰基-β-乙酰乳香酸(AKBA),均是治疗血瘀证药效物质。本课题拟在血瘀证机体,揭示HSYA-AKBA对药配伍“相须”“相使”的内在相互作用机制,为今后含有HSYA-AKBA的方剂和中成药研究提供创新性思路。实验目的:1、探讨HSYA和AKBA对药配伍是否可减轻心肌缺血损伤,对心肌损伤有“相须”“相使”保护作用。2、明确HSYA和AKBA对药配伍能否有“相须”“相使”的减少心肌缺血损伤诱导的氧化应激作用。3、进一步探究HSYA和AKBA对药配伍调控氧化应激信号通路(PGC-1α/Nrf2)在心肌损伤中的表达情况,明确该通路在心肌损伤中抗氧化应激作用机制。实验方法:体内研究采用皮下注射100mg·kg-1盐酸异丙肾上腺素(ISO)诱导大鼠心肌缺血损伤模型,复制血瘀证大鼠。体外研究采用暂时性氧糖剥夺(OGD)诱导H9C2心肌细胞缺血损伤模型。观察给予HSYA和AKBA后大鼠心电图的改变,采用苏木精-伊红染色法(H&E)观察心肌组织的病理性改变,检测体内、体外实验的肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)水平;并采用TUNEL染色法检测心肌细胞的凋亡情况和Hoechst33258染色法观察H9C2心肌细胞形态学改变。采用Mito-sox和JC-1检测线粒体内ROS量和线粒体膜电位,同时检测抗氧化系统丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的含量变化;并进一步采用免疫组化和蛋白印迹法来检测HSYA和AKBA对药配伍调控氧化应激信号通路过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α(PGC-1α)和核因子E2相关因子2(Nrf2)的蛋白表达。实验结果:1、HSYA和AKBA对药配伍对心肌损伤有保护作用。体内实验,HSYA和AKBA对药配伍对ISO所致大鼠心肌缺血损伤模型的心功能有改善作用;并逆转大鼠心肌组织病理性改变,能显著改善ISO诱导大鼠心肌损伤造成的心肌纤维增生、断裂,炎性细胞浸润,心肌间质水肿;能显著降低大鼠血清中心肌酶的CK-MB、LDH的含量(n=6,P<0.05);同时TUNEL染色法检测结果显示HSYA和AKBA对药配伍抑制心肌缺血损伤模型中心肌细胞的凋亡。在ISO治疗组,TUNEL阳性心肌细胞密集分布。HSYA和AKBA治疗组表现出较小的TUNEL阳性细胞,百分比分别从34.57%下降到19.47%或19.61%(n=6,P<0.05)。与HSYA或AKBA组比较,HSYA和AKBA对药配伍相须减少TUNEL阳性细胞(n=6,P<0.05)。体外实验,HSYA和AKBA对药配伍在H9C2心肌细胞OGD损伤模型中也得到类似保护心肌细胞的结果。显著降低H9C2心肌细胞心肌损伤酶的CK-MB、LDH的合成与释放;同时Hoechst33258染色法检测结果显示有抗细胞凋亡作用。2、HSYA和AKBA对药配伍有抗氧化应激损伤作用。HSYA和AKBA对药配伍合用相须降低线粒体内ROS的产生;同时能够减轻ROS在线粒体中累积对线粒体膜电位的影响作用,降低线粒体膜电位,维持粒线体膜完整性、稳定性。体内、体外实验证明了HSYA和AKBA对药配伍合用相须激活抗氧化酶系统,升高心肌组织的SOD酶活力,降低脂质过氧化酶MDA水平。表明了HSYA和AKBA对药配伍合用相须减少心肌缺血损伤是通过清除线粒体内ROS水平而获得的。3、HSYA和AKBA对药配伍促进心肌组织PGC-1α和Nrf2表达。采用心肌免疫组化分析和H9C2细胞免疫印迹检测确定PGC-1α/Nrf2的信号是否参与HSYA或AKBA的心脏保护作用。体内实验ISO诱导大鼠心肌损伤模型中心肌免疫组化分析表明HSYA和AKBA增加PGC-1α和Nrf2的表达。体外实验OGD诱导H9C2心肌细胞损伤模型中免疫印迹分析表明,HSYA和AKBA增加PGC-1α和Nrf2的表达。HSYA和AKBA对药配伍在心肌损伤中通过诱导PGC-1α和Nrf2表达促线粒体生物合成发挥抗氧化损伤的作用。实验结论:证实了HSYA和AKBA对药配伍对心肌损伤有协同“相须”保护作用,这种保护作用通过调节诱导PGC-1α和Nrf2表达促线粒体生物合成发挥抗氧化应激损伤的作用。