背景结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是常见的消化道恶性肿瘤,发病率位居2015年我国恶性肿瘤发病男性的第5位和女性第4位,估计2015年CRC新发病人数为37.6万人,死亡人数达到19.1万人。术后40%～50%患者出现术后复发或转移,其中绝大多数患者失去再治愈的机会；约20%病人在诊断时即处于转移阶段,其中位生存期低于2年,该类晚期或转移CRC对化疗药物的反应仅有10～20%,导致CRC的远期预后很差。在我国有不少中草药被认为具有抗炎抑瘤作用,故中草药在研发新型有效的抗肿瘤药物方面具有巨大的开发价值和应用前景。我们此前的研究显示,蟾酥成分沙蟾毒精诱导结肠癌细胞发生凋亡,线粒体磷酸甘油酸变位酶5L(Phosphoglycerate Mutase 5L, PGAM5L)与动力相关蛋白1以及Bax形成复合物对于内源性凋亡的执行是必需的。远华蟾蜍精(Telocinobufagin, TBG)是从中华大蟾蜍蟾酥中提取纯化的活性成分之一,但TBG对CRC的作用尚未有报道。目的本实验旨在分析TBG对CRC细胞活力的影响并对其可能的分子机制进行探讨。方法1.细胞培养结肠癌细胞HCT116(WT)、SW480、HCT116(Bax-/-)及HCT1 16p53-/-)及人正常肠上皮细胞NCM460给予常规复苏,用含有10%胎牛血清,青／链霉素各1 00U/ml的RPMI1640/DMEM/McCoy’s5A培养基,置于37℃、5%CO2饱和湿度条件下的培养箱中贴壁培养。实验时取对数生长期的细胞。2.MTT法检测细胞活力收集对数期细胞,调整细胞密度约10000/孔。待细胞贴壁后,分别加入浓度梯度的TBG(0.1μM、1.0μM、2.5μM、5μM、10μM),每孔100μl,继续培养24 h。每个浓度设4个复孔,同时设立空白对照组,分别培养24、48h后,每孔中加入5 mg/ml,MTT 20μl,继续培养4 h。弃旧液,每孔加入150μlDMSO,置摇床振荡10 min,至紫色结晶完全溶解。酶联免疫检测仪D490 nm处测量吸光值。细胞生存率=处理组吸光度值／对照组吸光度值。实验重复3次。3.流式细胞术检测细胞凋亡坏死情况收集对数期细胞以1×105／孔接种于6孔板中,待细胞贴壁后,分别加入浓度梯度的TBG(0μM、0.1μM、1.00M、2.5μM、5gM/10gM),每孔1 ml,继续培养24 h。按照Annexin V-PE/7AAD细胞凋亡检测试剂盒说明书进行,采用流式细胞仪测定,根据Annexin V-PE(X轴)/7AAD(Y轴)荧光做对数散点图,可获得由4个象限组成的双参数图：左上象限(K1)为细胞收集过程中产生的损伤细胞,右上象限(K2)为晚期凋亡细胞和坏死细胞,左下象限(K3)为活细胞,右下象限(K4)为早期凋亡细胞,每个象限的细胞数即为受检总细胞数中所占的比例。实验重复3次。4.Hoechst 33342/PI荧光核染色取对数期HCT116系列细胞以1×104/孔接种于96孔板中,待细胞贴壁后,分别加入浓度梯度的TBG(0μM、0.1 μM、1.0μM、2.5μM),每孔100μl,继续培养24 h。用PBS将20mg/mlHoechst33342储存液制备成5-10gg/ml工作液,贴壁细胞弃培养基,用PBS清洗1-2次。每孔加入35μlHoechst33342工作液,置于37℃温育15-20 min。弃去Hoechst33342染液,每孔再加入10μg/ml PI染色液1.4μ1,避光37℃孵育5-10min,PBS洗涤1-2次,用荧光显微镜拍照分析。5.ROS和线粒体膜电位分析应用DCFH-DA检测细胞内ROS。加入JC-1(终浓度1Ong/ml),DCFH-DA孵育30 min,无血清培养液冲洗细胞3次,15 min内各孔荧光强度流式细胞仪检测,结果以与对照组ROS含量的百分比表示。6.Western blot检测相关蛋白表达取对数期HCT116系列细胞以1×105/孔接种于3cm培养皿中,待细胞贴壁后,分别加入浓度梯度的TBG(0μM、0.1μM、1.0μM、2.5μM),每孔3 ml,继续培养24 h。收集悬浮及贴壁细胞,用预冷的PBS洗涤2遍,RIPA细胞裂解液于冰浴裂解30 min,以12000r/min速率离心20 min,离心半径8.2 cm,吸取上清液。用BCA法蛋白定量后,每组取约30μg蛋白样品,加入5倍上样缓冲液后进行12%SDS-PAGE,将湿转法转印至PVDF膜。5%脱脂奶粉室温封闭1 h。一抗4℃孵育过夜。HRP偶联的相应二抗(1：1000稀释)室温孵育lh。最后用化学发光法显色、曝光。每组样品重复上样检测3次。目的条带用Image J软件分析相对灰度值(以β-actin为参照)。7.应激与凋亡信号抗体芯片检测作用靶点变化细胞处理方法同WB,按照抗体芯片使用说明书,先用配套裂解液裂解细胞,收集蛋白,用BCA法进行蛋白定量后,每组取约0.5-1μg/μl浓度的蛋白样品加入组装好的对应黑色多孔隔离槽中过夜孵育。次日用试剂盒中的复合一抗室温震荡反应1h,HRP偶联的相应二抗室温震荡孵育0.5h。最后配置混合后显影试剂用化学发光数字成像仪曝光。重复检测3次。目的靶点用Image J软件分析相对灰度值(以阳性对照为参照)。8.统计学方法所有实验至少重复3次,相关实验数据采用SPSS 20.0软件进行统计分析,计量资料数据结果以均数±标准差(χ±SD)表示。组间比较单因素方差分析采用One-Way ANOVA,随机单位组设计材料的方差分析采用Two-Way ANOVA.若方差齐多重比较采用LSD方法检验,若方差不齐多重比较采用Dunnett’s T3法检验,P<0.05被认为差异具有统计学意义。结果1.TBG抑制CRC细胞活力用0.1μM、1μM、2.5μM、5μM、10μM的TBG分别作用于HCT116和SW480细胞12h、24h、48h后,HCT116和SW480细胞各生存曲线随着浓度梯度呈现基本平行显著下降趋势,具有时间剂量依赖性(药物效应和时间效应P<0.01),其中HCT116细胞总平均生存率为58.32%±24.98%,SW480细胞总平均生存率为65.86%±23.15%,到5μM细胞增殖抑制率已经达到平台水平,HCT116细胞的24 h IC50值为3.93μM,SW480细胞的24h IC50值为5.10μM,结果表明远华蟾蜍精对两种结肠癌细胞生长均有明显的抑制作用,其中HCT116细胞在24h0.1μM、1μM、2.5μM处具有更好的药物敏感性。2.TBG对人正常肠上皮细胞的杀伤作用较CRC细胞减弱TBG作用12h、24h、48h后,NCM460细胞处理组间细胞存活率均具有差异性(P<0.05),说明远华蟾蜍精对人正常肠上皮细胞生长也有明显抑制效果,具有一定毒性,与HCT116细胞总平均生存率为58.32%±24.98%,SW480细胞总平均生存率为65.86±23.15对比,NCM460细胞总平均生存率为73.03%±19.47%,NCM460细胞的24 h IC50值为34.7μM,较CRC细胞24 h IC50值降低,表明TBG对人正常肠上皮细胞敏感性较低,对CRC肿瘤细胞有更强杀伤作用。3.TBG诱导CRC细胞发生凋亡坏死,胞核形态改变PI染色情况：在TBG 24h作用下,随着药物浓度升高,HCT116和SW480细胞的PI染色率呈梯度升高,胞核出现明显肿胀,甚至出现细胞结构破坏,SW480细胞在1μM、2.5μM处PI染色率高于HCT116细胞。Hoechst染色情况：在TBG 24h作用下,HCT116和SW480细胞的Hoechst染色率随着浓度增长有升高趋势,着色细胞出现胞核固缩和凋亡小体现象,两种细胞Hoechst染色情况相近。结果表明远华蟾蜍精诱导结肠癌细胞死亡方式是坏死和凋亡,其中以坏死方式为主。4.TBG显著增加CRC细胞凋亡率和坏死率坏死率变化：不同细胞处理组间细胞坏死率有明显差异,HCT116细胞在1μM、2.5μM、5μM处坏死率分别为23.38%、36.14%和34.42%,显著高于空白组(P<0.01),而SW480细胞在0.1μM、1μM、2.5μM、5μM处坏死率分别为23.82%、38.95%、60.87%和58.92%,与空白组对照差异明显(P<0.01)。凋亡率变化：与control组对比,随着浓度梯度升高,结肠癌细胞处理组凋亡率呈剂量依赖变化,HCT116细胞在0.1μM、1μM、2.5μM、5μM处凋亡率分别为7.38%、9.50%、11.23%和10.26%(P<0.01),而SW480细胞在1μM、2.5μM、5μM处凋亡率分别为2.91%、8.18%、15.09%和15.61%(P<0.01)。上述结果表明,远华蟾蜍精主要通过坏死,其次为凋亡的方式诱导结肠癌细胞死亡,以0.1μM、1μM、2.5μM处理组变化明显,5μM达到药效平台,该现象与生长曲线和胞核染色变化规律基本相符。5.TBG诱导HCT116细胞内ROS增加和线粒体膜电位降低在0.1μM、1μM、2.5μMTBG的作用下,应用荧光探针CM-H2DCFDA观察细胞内ROS,可以发现TBG显著增加细胞内ROS水平,与0μM对比(15.83%±1.61%),各作用浓度ROS含量百分比分别是23.97%±3.28%,43.80%±2.75%,58.08%±2.57%。应用JC-1染色监测线粒体膜电位,发现TBG以剂量依赖的方式显著降低CRC细胞线粒体膜电位,经统计与空白组对比(7427±372.1),其线粒体膜电位荧光强度分别是4525±324.4,3627±370.6,3090±350.2。由此表明TBG作用HCT16细胞24h后,能促使细胞内线粒体膜电位降低,线粒体通透性改变,同时使胞内ROS大量产生,引起氧化应激反应。6.TBG引起HCT116细胞应激与凋亡通路的活化与空白对照组比较,p53蛋白在0.1μM和1μM处表达上调(P<0.05),在1μM、2.5μM处,Bax蛋白表达增强(P<0.05),caspase9蛋白出现片段化(P<0.05),从0.1μM到2.5μM,cyto-C蛋白有表达上升趋势(P<0.05),PARP蛋白片段化趋势上升(P<0.05),但AIF蛋白表达变化不大(P>0.05)。以0μM为参照,RIP蛋白表达稳定(P>0.05),COX-2蛋白0.1μM和1μM处表达增强(P<0.05),在0.1μM、1μM、2.5μM处,RIP3和NOX-1均有明显表达增强趋势(P<0.05)。综合上述WB结果,初步推断TBG诱导p53和Bax的活化,cyto-C的释放,导致Caspase 9和PARP发生剪切进而激活凋亡通路,通过增强COX-2、RIP3和NOX-1蛋白表达,触发细胞内氧化应激反应,诱导细胞发生坏死,但这死亡与AIF、RIP蛋白无关。7.敲除p53、Bax基因后,TBG抑制HCT116细胞增殖能力明显减弱不同浓度TBG作用24h后,与野生型HCT116细胞比较,同一药物浓度下,HCT116(Bax-/-)和HCT1 16p53-/-)细胞存活率均显著升高(P<0.01),其中HCT116(Bax-/-)细胞存活率保持90%以上。结果表明,当p53和Bax基因敲除后,均使TBG对HCT116细胞抑制增殖能力减弱,细胞存活率得以恢复,说明TBG对HCT116细胞抑制增殖作用可能受到两者调控。8.敲除p53、Bax基因后,TBG引起HCTI16细胞凋亡率和坏死率逐渐减少通过敲除p53和Bax基因,HCT116细胞坏死率和凋亡率均发生明显改变,HCT116(Bax-/-)和HCT116(p53-/-)细胞凋亡率和坏死率的明显减少,说明p53和Bax基因可参与调控TBG诱导CRC细胞的死亡过程。9.敲除p53、Bax基因后,TBG引起HCTI16细胞应激与凋亡通路的活化受阻当Bax基因敲除后,以野生型HCT116细胞为参照,凋亡蛋白中,p53蛋白表达上调,cyto-C蛋白表达下调,caspase9和PARP蛋白片段化趋势减弱。当敲除p53基因后,跟HCT116(WT)比较,凋亡蛋白Bax、cyto-C、片段化caspase9和PARP均有明显表达减弱趋势。由此推断TBG诱导HCT116细胞凋亡与p53/Bax/cyto-C/caspase9/PARP蛋白激活后表达上调有关,其细胞坏死与COX-2、RIP3和NOX-1蛋白表达增强相关。当HCT116细胞中p53和Bax基因被敲除后,应激与凋亡通路的相关蛋白激活受阻,说明p53和Bax基因参与调控TBG诱导HCT116细胞发生死亡。10.抗体芯片也证实TBG能引起HCT116细胞中的凋亡靶点表达改变被标记的蛋白从O.1μM到2.5μM均有显著表达差异,其中片段化PARP蛋白有表达上升趋势(P<0.05),磷酸化TAK 1蛋白(P<0.05)、IκBα.总蛋白及磷酸化蛋白(P<0.01)和survivin蛋白(P<0.01)则有明显下降趋势,而磷酸化Bad蛋白在1μM和2.5μM处表达增强(P<0.05),芯片上的其他靶点如p53、片段化caspase3/7等蛋白没有表达差异。上述结果表明,TBG显著增加Bad磷酸化和PARP的片段化,与Western blot结果一致。磷酸化IκBα、磷酸化TAK1以及Survivin的蛋白表达在TBG作用下呈下降趋势。上述结果均表明TBG可能通过调节多个应激与凋亡信号分子途径诱导CRC细胞发生凋亡。结论TBG能显著抑制CRC细胞增殖,其凋亡诱导作用可能与p53介导的Bax通路活化及IAP通路的阻断相关,其坏死诱导作用可能与RIP3、COX-2、NOX-1蛋白表达升高有关。