卵巢癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一,也是死亡率最高的女性生殖系统肿瘤。根据WHO组织学分型,上皮性卵巢癌(epithelia ovarian cancer,EOC)是卵巢癌中最多见的组织学类型,EOC的标准治疗方案为“初次理想的肿瘤细胞减灭术+以铂类为基础的联合化疗”,临床工作中我们发现尽管化疗是其最重要的辅助治疗手段,但很多患者在治疗过程中出现原发或继发性化疗耐药,使化疗效果不理想,复发率和死亡率居高不下,因此对卵巢癌转移、复发及耐药过程中参与的生物分子的研究已成为卵巢癌研究热点。通过对卵巢癌生物学和代谢机制的探索,期望找出卵巢癌分子靶向治疗的有效靶点已成为目前卵巢癌研究的重要课题。研究发现,miRNA在细胞的调控方面具有重要作用,一方面miRNA通过控制癌细胞的启动,调控癌细胞的增殖、侵袭和凋亡;另一方面作为与卵巢癌细胞耐药密切相关的信号通路的上游或下游的效应因子,miRNA可以促进或抑制肿瘤细胞的凋亡从而提高或降低卵巢癌细胞的化疗敏感性。通过查阅大量文献发现miR-199a-3p在多种癌症中异常表达,如肝癌、前列腺癌或乳腺癌等,但是miR-199a在卵巢癌中作用的研究报道并不多见。在前期工作中我们通过芯片筛选并PCR验证发现miR-199a-3p在铂类耐药的卵巢癌细胞中表达水平下调,明显低于铂类敏感细胞中的表达水平,提示miR-199a-3p可能在维持或调节卵巢癌生物学行为中发挥重要作用。miR-199a-3p在卵巢癌细胞中的差异表达具有何种意义?miR-199a-3p对卵巢癌生物学行为有何影响?miR-199a-3p在卵巢癌细胞复发、转移和耐药中发挥作用的调控机制是什么?为了回答上述问题,本研究选择miR-199a-3p作为卵巢癌发展和耐药的研究靶点。通过临床、细胞及活体不同水平的研究,初步探讨miR-199a-3p在上皮性卵巢癌中的临床意义及miR-199a-3p在EOC的发展及铂类化疗耐药中的作用和可能调控机制。整合素是细胞表面粘附分子的一种,由α和β两个次级别单位通过非共价键连接形成的细胞跨膜蛋白,胞外连接基质蛋白或相邻细胞,胞内连接细胞骨架系统,从而构成肿瘤细胞赖以生存发展的空间纽带;另一方面,整合素作为受体可与多种细胞因子结合,从而向细胞内外双向传导生物信息,构成肿瘤细胞感受外界刺激并做出相应反应的的信息枢纽。近年研究发现整合素表达于恶性肿瘤表面,并在肿瘤转移、复发和化疗耐药中表达上调,整合素可能参与了肿瘤细胞的侵袭、转移和化疗药物诱导的肿瘤细胞凋亡过程。利用生物信息分析软件预测及双荧光素酶报告基因验证miR-199a-3p在卵巢癌中的靶基因为ITGB8(Integrinβ8,整合素β8),通过进一步实验证明miR-199a-3p对ITGB8的靶向调控在EOC发展及铂类耐药中发挥的作用,初步探讨miR-199a-3p/ITGB8信号通路参与EOC发展及铂类耐药的机制。目前,关于miR-199a-3p通过ITGB8参与EOC发展及铂类耐药的机制尚无报道,本研究将为miR-199a-3p在EOC发展及铂类耐药中的作用提供有力的直接证据。研究目的研究miR-199a-3p在EOC中的临床意义及miR-199a-3p通过靶向调控ITGB8对卵巢癌细胞生物学行为的影响。初步探讨miR-199a-3p在EOC的发展和铂类耐药中的作用和分子机制,为控制EOC的发展和化疗耐药提供候选靶点和理论支持。研究方法1.以正常卵巢组织、良性及交界性卵巢肿瘤及EOC铂类耐药和铂类敏感病例的病理切片及临床资料为研究对象,q RT-PCR法对不同组别miR-199a-3p表达水平进行检测,统计分析miR-199a-3p基因表达差异与EOC临床病理因素、铂类耐药的相关性;2.选取卵巢癌亲本株SKOV3细胞进行细胞培养,并通过浓度递增的方法构建SKOV3/DDP(SKOV3顺铂耐药细胞)细胞株,通过MTT、Transwell和Wound healing方法检测SKOV3/DDP及SKOV3在细胞耐药指数、迁移和侵袭等方面的生物学效能,通过q RT-PCR方法检测SKOV3和SKOV3/DDP中miR-199a-3p表达水平的差异;3.脂质体法用miR-199a-3p mimic和miR-199a-3p inhibitor分别转染SKOV3/DDP及SKOV3细胞,通过MTT、Transwell和Wound healing方法检测转染后SKOV3/DDP及SKOV3细胞耐药指数、迁移、侵袭能力和细胞凋亡的变化,初步分析miR-199a-3p对卵巢癌细胞生物学行为的影响;4.利用生物信息分析软件预测并查阅文献总结miR-199a-3p可能靶基因,q RT-PCR和WB方法检测SKOV3/DDP及SKOV3细胞中可能靶基因m RNA表达水平和蛋白表达水平;综合分析ITGB8是miR-199a-3p的可能靶基因;5.通过脂质体法分别转染miR-199a-3p mimic和miR-199a-3p inhibitor后检测SKOV3/DDP及SKOV3细胞中ITGB8表达的变化进一步验证miR-199a-3p对ITGB8的靶向调控作用;6.通过双荧光素酶报告基因验证证实ITGB8是miR-199a-3p的靶基因,并确定了miR-199a-3p与ITGB8的结合位点;7.利用重组质粒技术构建ITGB8过表达载体:在NCBI网站查找ITGB8基因序列,找出ITGB8的ORF,根据pc DNA3.1的载体图谱选择合适的酶切位点,设计引物,通过PCR的方式克隆目的基因,被消化后插入pc DNA3.1,构建pc DNA3.1-ITGB8重组质粒;8.通过脂质体法用miR-199a-3pmimic、inhibitor和(或)pc DNA3.1-ITGB8分别转染卵巢癌SKOV3/DDP及SKOV3细胞,分析miR-199a-3p通过靶向调控ITGB8对卵巢癌细胞生物学行为的影响;9.MTT法检测不同转染组对顺铂的化疗敏感性;Transwell检测不同转染组细胞侵袭能力;划痕实验检测不同转染组细胞迁移能力,分析miR-199a-3p通过靶向调控ITGB8对卵巢癌细胞化疗耐药、侵袭和转移能力的影响。10.流式细胞术检测各个转染组的细胞周期和凋亡的变化,分析miR-199a-3p通过靶向调控ITGB8对卵巢癌细胞增殖和凋亡的作用。11.构建卵巢癌原位异种模型:分别注射SKOV3和SKOV3/DDP细胞悬液于裸鼠卵巢包膜下,成瘤后比较卵巢原位移植瘤大小、重量及腹腔转移结节数目等。12.通过q RT-PCR方法检测分别注射SKOV3和SKOV3/DDP细胞后成瘤的卵巢原位移植瘤组织标本中miR-199a-3p表达水平。13.通过q RT-PCR和Westen-Blot方法检测注射SKOV3和SKOV3/DDP细胞后成瘤的卵巢原位移植瘤组织标本中ITGB8的m RNA表达水平和蛋白表达量。研究结果1.miR-199a-3p在EOC中的临床意义及其与铂类耐药的关系(1)与正常卵巢组织相比,miR-199a-3p的表达在卵巢良性上皮性肿瘤中无明显差异,卵巢交界性肿瘤中轻微下降,而EOC中明显下降;(2)相对于EOC铂类敏感组织,耐药组织中miR-199a-3p的相对表达水平明显下降,提示miR-199a-3p与EOC的耐药有相关性;(3)根据手术病理分期,随着卵巢癌期别增加,miR-199a-3p的表达逐渐减少;不同组织学分级中,分化程度越差,miR-199a-3p的表达水平越低;在有无合并淋巴转移中,伴淋巴转移者较无淋巴转移者miR-199a-3p的表达明显减低;不同组织学类型miR-199a-3p的表达未见明显差异。说明miR-199a-3p的表达水平与EOC分期、分化程度及淋巴有无转移等临床特征具有相关性,随着EOC分期和恶性程度的升高,miR-199a-3p表达水平呈逐渐下降趋势,miR-199a-3p与EOC的发展相关。2.miR-199a-3p在卵巢癌细胞中的表达及其对卵巢癌细胞生物学行为的影响(1)培养并构建卵巢癌顺铂耐药细胞系SKOV3/DDP,在细胞化疗耐药、迁移和侵袭等生物学效能方面,SKOV3/DDP细胞均明显强于SKOV3细胞;(2)SKOV3/DDP细胞中miR-199a-表达水平明显低于SKOV3细胞;(3)上调miR-199a-3p的表达,SKOV3/DDP细胞对顺铂的耐药性下降,敏感性增加,显著促进顺铂介导的凋亡,抑制癌细胞生长、迁移和侵袭能力;下调miR-199a-3p的表达,SKOV3细胞对顺铂的敏感性下降,耐药性增加,显著抑制顺铂介导的凋亡,增强癌细胞生长、迁移和侵袭能力;提示miR-199a-3p在EOC中具有抑癌基因的作用,抑制卵巢癌细胞的生长、侵袭和迁移,促进卵巢癌细胞的凋亡,并增加卵巢癌细胞对顺铂的化疗敏感性;3.miR-199a-3p靶向调控ITGB8(1)生物信息分析及文献总结miR-199a-3p的可能靶基因,q RT-PCR和WB方法检测SKOV3/DDP及SKOV3中这些可能靶基因m RNA表达水平和蛋白表达水平,在这些可能靶基因中ITGB8表达及变化显著;(2)利用生物信息功能分析miR-199a-3p靶基因中ITGB8与miR-199a-3p关联性强,而整合素与卵巢癌的发展和化疗耐药相关;(3)miR-199a-3p表达下调时,ITGB8蛋白表达水平升高;miR-199a-3p表达上调则显著抑制ITGB8蛋白表达水平,miR-199a-3p对ITGB8呈负向调控作用。(4)双荧光素酶报告基因实验证实miR-199a-3p直接靶向调控ITGB8,ITGB8-3’UTR-2是miR199a-3p和ITGB8的靶结合位点;4.miR-199a-3p通过直接靶向调控ITGB8影响卵巢癌细胞生物学行为(1)构建pc DNA3.1-ITGB8重组质粒,过表达ITGB8;(2)下调miR-199a-3p或上调ITGB8时,卵巢癌细胞对顺铂的敏感性降低,耐药性增加,同时下调miR-199a-3p并上调ITGB8时卵巢癌细胞对顺铂的敏感性进一步降低,耐药性进一步增加,说明下调miR-199a-3p可以增强ITGB8的作用;另一方面,当miR-199a-3p表达上调,细胞对顺铂敏感性增加,耐药性减低,同时上调miR-199a-3p和ITGB8时,ITGB8的作用被抑制,说明下调miR-199a-3p可以抑制ITGB8的作用。(3)ITGB8表达上调时,SKOV3细胞的迁移和侵袭能力增加,下调miR-199a-3p可以增强ITGB8的这一作用;上调miR-199a-3p则降低ITGB8的这一作用。(4)流式细胞技术检测不同转染组细胞周期和细胞凋亡率显示:上调ITGB8的表达可以显著抑制细胞增殖和顺铂介导的凋亡,下调miR-199a-3p可以增强ITGB8的这一作用;上调miR-199a-3p则降低ITGB8的这一作用。(5)构建卵巢癌原位异种模型,与注射SKOV3组小鼠模型相比,SKOV3/DDP组裸鼠模型形成较多的腹腔转移结节,卵巢原位肿瘤的体积更大,重量更重;肿瘤组织内miR-199a-3p的表达水平明显降低,ITGB8 m RNA表达水平和蛋白含量明显升高。结论1.miR-199a-3p的表达随EOC恶性程度及分期的升高而下降,并在铂类耐药组织中表达水平下降,说明miR-199a-3p与EOC的发展和铂类耐药相关;2.miR-199a-3p通过直接靶向作用负向调控ITGB8,促进癌细胞凋亡,增强卵巢癌细胞对顺铂的化疗敏感性;3.miR-199a-3p通过直接靶向作用负向调控ITGB8抑制卵巢癌细胞的生长、侵袭和转移;4.在动物模型内,与卵巢癌亲本细胞相比,卵巢癌顺铂耐药细胞原位成瘤能力及转移能力更强,其原位肿瘤组织内miR-199a-3p的表达水平下降,ITGB8的表达增加;5.miR-199a-3p/ITGB8信号通路在EOC发展和铂类化疗耐药中发挥了抑癌基因的作用。当miR-199a-3p表达下调,通过上调靶基因ITGB8的表达,增加卵巢癌细胞的生长、侵袭和转移,从而促进卵巢癌的发展;同时使癌细胞的凋亡减少,通过卵巢癌铂类耐药中的靶后机制导致化疗耐药,miR-199a-3p有望成为卵巢癌靶向治疗的新的生物分子。