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日本血吸虫感染宿主后寄生于门脉-肠系膜系统,产的卵随血流沉积于肝脏,发育成熟的虫卵合成并分泌可溶性虫卵抗原（soluble egg antigen,SEA）,诱导肝脏产生肉芽肿病变并继发纤维化。肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）在肝纤维化的形成和发展中起重要作用,静息状态的HSCs被SEA活化并合成细胞外基质（extracellular matrix,ECM）,当胶原的合成速度大于降解速度时,纤维化发生。近年来,长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）在肝纤维化中的调控作用已成为研究热点之一。本课题拟探索5个lncRNA在参与日本血吸虫病肝纤维化过程中的作用及机制,分别是生长抑制特异性转录本5（Growth arrest specific transcript 5,GAS5）、基因间长链非编码 RNA-p21（Long intergenic non-coding RNA-p21,lincRNA-p21）、浆细胞瘤多样异位基因 1（Plasmacytoma variant translocation gene 1,PVT1）、lncRNA-H19 和肺腺癌转移相关转录本1（Metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1）。本研究建立了日本血吸虫尾蚴感染野生型小鼠和ICOS转基因小鼠（ICOS-Tg小鼠）致肝纤维化的动物模型,分离感染不同病期小鼠的原代HSCs,用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分别检测5个lncRNA的表达水平,观察它们在疾病进程中的动态变化和表达差异,探究ICOSL/ICOS信号调控相关lncRNA介导肝纤维化的潜在机制。本研究还在TGF-β1或IL-33活化的小鼠肝星状细胞系（JS-1细胞）中用siRNA干扰lncRNA的表达,检测在此过程中相关纤维化因子的变化,进一步探究lncRNA调控HSCs活化的机制。一、日本血吸虫感染FVB-WT小鼠不同病期相关lncRNA在原代HSCs中的动态表达目的:检测日本血吸虫感染FVB-WT小鼠不同病期相关lncRNA在原代HSCs中的动态表达。方法:1.日本血吸虫尾蚴经腹部感染FVB-WT小鼠,建立肝纤维化动物模型,收集未感染、感染早期、急性期和慢性期的小鼠肝脏标本,用HE染色和Masson染色观察各个病期单个虫卵肉芽肿面积和分泌的胶原蛋白沉积面积。2.用原位肝脏酶灌注法和密度梯度离心法分离不同病期小鼠的原代HSCs,台盼蓝染色鉴定细胞存活率,计数自发荧光阳性细胞比例和GFAP免疫荧光阳性细胞比例鉴定细胞纯度。3.分离的原代HSCs培养7天后提取总RNA,qRT-PCR检测不同病期lncRNA-GAS5、lincRNA-P21、lincRNA-PVT1、lncRNA-H19 和 lncRNA-MALAT1的表达水平,观察其在肝纤维化进程中的动态变化。结果:1.HE染色显示:未感染的小鼠肝脏细胞形态和肝小叶结构均未见明显异常,感染后4周有少量炎性细胞浸润,感染后7周形成虫卵肉芽肿,且此时肉芽肿面积最大（7.94±0.437×104μm2）,感染后9周和12周逐渐缩小。Masson染色显示,未感染的肝脏几乎无胶原蛋白分泌,感染后4周分泌极少,感染后7周开始分泌的胶原蛋白沉积面积逐渐增大。2.分离的小鼠原代HSCs生长状态良好,分化明显,每只小鼠获得的HSCs数量可达（1.91±0.2）×106个,经台盼蓝染色鉴定存活率达到90%以上,在活细胞工作站下可观察到细胞自发的蓝绿色荧光,经GFAP免疫荧光染色后可观察到胞质中的红色荧光,计数荧光细胞比例可得细胞纯度在90%以上。3.qRT-PCR检测FVB-WT小鼠原代HSCs中5个lncRNA的表达水平可得:感染后4周lncRNA-GAS5的表达量增加,感染后7周达到最高值（5.44±0.880）,之后表达量逐渐减少;感染后4周lincRNA-P21的表达开始升高,感染后7周和9周均维持在较高水平（7周:7.87±1.23;9周:8.00±0.994）,感染后12周降低;lincRNA-PVT1的表达量在感染后4周、7周和9周均较高,其中感染后7周为最高值（5.07±0.531）;lncRNA-H19和lncRNA-MALAT1的表达均在感染后4周和7周升高,感染后9周和12周逐渐降低。结论:日本血吸虫感染致肝纤维化过程中,这5个lncRNA总体而言都随着肝脏纤维化的加重呈先升高后降低的趋势。lncRNA-GAS5和lincRNA-P21在感染急性期（感染后7周和9周）表达较高;lincRNA-PVT1、lncRNA-H19和lncRNA-MALAT1在感染后4周进展到感染后7周过程中有较高的表达水平。说明它们有作为肝纤维化调控靶点的潜能。二、ICOSL/ICOS信号对日本血吸虫感染小鼠不同病期相关lncRNA在原代HSCs中动态表达的影响目的:检测日本血吸虫感染ICOS-Tg小鼠肝纤维化不同病期相关lncRNA在原代HSCs中的表达水平,比较FVB-WT小鼠和ICOS-Tg小鼠肝纤维化模型中相关lncRNA的表达差异。方法:1.日本血吸虫尾蚴经腹部感染ICOS-Tg小鼠,建立肝纤维化模型,收集未感染、感染早期、急性期和慢性期小鼠的肝脏标本,分别用HE染色和Masson染色观察各个病期单个虫卵肉芽肿面积和分泌的胶原蛋白沉积面积。2.使用原位肝脏酶灌注法和密度梯度离心法分离不同病期ICOS-Tg小鼠的原代HSCs,培养7天后提取细胞的总RNA,通过qRT-PCR检测各个病期lncRNA-GAS5、lincRNA-P21、lincRNA-PVT1、lncRNA-H19 和 lncRNA-MALAT1的表达水平,分别比较其与FVB-WT小鼠肝纤维化模型同时期的表达差异。结果:1.HE染色和Masson染色显示:ICOS-Tg小鼠感染日本血吸虫尾蚴7周后,小鼠的肝脏单个虫卵肉芽肿面积和分泌的胶原蛋白沉积面积与同时期的FVB-WT小鼠相比均显著增加[虫卵肉芽肿面积:（12.1±4.00）×104μm2vs（7.93±0.427）×104μm2;胶原蛋白沉积面积:（7.64±0.282）×104μm2 vs（7.14±0.468）×104μm2]。2.qRT-PCR检测ICOS-Tg小鼠原代HSCs中5个lncRNA的表达水平,并与FVB-WT小鼠比较可知:lncRNA-GAS5和lincRNA-P21的表达量在感染后7周和9周均显著低于同时期的FVB-WT小鼠（lncRNA-GAS5:感染后7周3.23±0.760 vs 5.44±0.880,9 周 2.04±0.503 vs 4.03±0.257;lincRNA-P21:感染后7周2.40±0.603 vs 7.87± 1.23,9 周 5.01± 0.551 vs 8.00±0.994）;lincRNA-PVT1 和lncRNA-H19的表达量在感染后7周高于同时期的FVB-WT小鼠（lincRNA-PVT1:7.43± 1.07 vs 5.07± 0.531;lncRNA-H19:1.65 ± 0.0660 vs 1.15± 0.0100）;lncRNA-MALAT1的表达量在感染后7周低于同时期的FVB-WT小鼠（2.19±0.0550 vs 4.39±0.500）,但在感染后9周高于同时期的FVB-WT小鼠（1.87±0.186 vs 0.793± 0.0550）。结论:在日本血吸虫感染致纤维化小鼠模型中,ICOS-Tg小鼠上调ICOSL/ICOS信号后,肝脏虫卵肉芽肿面积和分泌的胶原蛋白量均显著增加,小鼠肝纤维化程度加重。相关lncRNA的表达水平也随之发生变化:lncRNA-GAS5和lincRNA-P21的表达水平在感染急性期较FVB-WT小鼠降低,推测它们可能有抑纤维化作用;lncRNA-PVT1和lncRNA-H19的表达水平在感染急性期较FVB-WT小鼠升高,推测它们可能有促纤维化作用。实验结果表明,在小鼠血吸虫病肝纤维化进程中,上调ICOSL/ICOS信号可以调控相关lncRNA介导小鼠肝纤维化的发生发展。三、体外干扰4种lncRNA表达对肝纤维化相关因子的影响目的:观察活化的JS-1细胞在下调相关lncRNA表达后对肝纤维化相关因子Ⅲ型胶原（col-Ⅲ）和透明质酸（HA）的影响。方法:用TGF-β1或IL-33作用体外培养的JS-1细胞24h后使其活化,转染siRNA,分别下调 lncRNA-GAS5、lincRNA-P21、lincRNA-PVT1 或 lncRNA-H19的表达,培养48h后提取细胞RNA,qRT-PCR检测col-Ⅲ的表达水平;同时收集细胞培养上清液,通过酶联免疫吸附实验检测HA的表达水平。结果:1.TGF-β1作用JS-1细胞后lncRNA-GAS5和lincRNA-P21的表达水平降低（lncRNA-GAS5:0.744± 0.0515;lincRNA-P21:0.736±0.0207）,lincRNA-PVT1和 lncRNA-H19的表达水平升高（lincRNA-PVT1:1.46±0.146;lncRNA-H19:1.52±0.144）。IL-33作用后得到了相同的趋势。2.TGF-β1 或 IL-33作用JS-1细胞后col-Ⅲ的表达升高（TGF-β1:1.45±0.116;IL-33:1.64±0.0981）。在 TGF-β1 活化后的 JS-1 细胞中下调 lncRNA-GAS5 或lincRNA-P21 表达,col-Ⅲ的水平进一步升高（lncRNA-GAS5:2.39±0.200;lincRNA-P21:2.09±0.110）;下调 lincRNA-PVT1 或 lncRNA-H19 表达后 col-Ⅲ的水平降低（lincRNA-PVT1:0.797±0.0676;lncRNA-H19:0.794±0.0482）。IL-33作用后也得到了相同趋势。3.TGF-β1或IL-33作用JS-1细胞后HA的表达水平升高（TGF-β1:20.3±1.30ng/ml;IL-33:14.7± 0.553ng/ml）,而在 TGF-β1 活化的 JS-1 细胞中干扰这 4种lncRNA的表达,HA的表达水平均进一步升高（lncRNA-GAS5:32.4±1.78ng/ml;lincRNA-P21:27.7± 1.73ng/ml;lincRNA-PVT1:25.9±0.968ng/ml;lncRNA-H19:30.4±1.41ng/ml）。同样,IL-33作用后可得到相同趋势。结论:体外用TGF-β1或IL-33活化JS-1细胞后,肝纤维化相关因子col-Ⅲ和HA的表达水平均升高。抑制lncRNA-P21或lncRNA-GAS5的表达后col-Ⅲ在此基础上进一步升高,而抑制lncRNA-PVT1或lncRNA-H19的表达后col-Ⅲ的表达在此基础上降低。但HA的表达在下调这4种lncRNA后均表达增加。表明在体外激活的HSCs中,调节相关lncRNA的表达可能影响HSCs的活化,进而导致col-Ⅲ表达变化。而干扰相关lncRNA表达后导致的HA水平进一步上升也印证了 lncRNA与HSCs活化的相关性,不过两者间的复杂关系还需要深入探究。