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研究背景及目的: 衰老是缺血性心脏病的主要独立危险因子。衰老的心脏心功能下降、缺血/再灌注后梗死面积增加、老年心梗患者的预后比青年人差,提示衰老心脏对缺血性心脏疾病易感性增加,但其机制并不十分清楚。近年来的研究发现,随年龄增长而增加的心肌细胞凋亡在其中具有重要作用。新近的研究提示,心肌细胞线粒体功能的持续降低是衰老心肌细胞凋亡增加的潜在原因。我们的前期研究发现衰老大鼠心肌组织硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx)氧化还原系统功能降低可通过线粒体途径促进衰老心肌细胞凋亡,但机制仍需进一步探讨。本研究首先探讨了衰老大鼠心肌细胞中Trx系统唯一的还原酶——硫氧还蛋白还原酶(Thioredoxin Reductase,TrxR)硝基化失活在促进线粒体途径导致的心肌细胞凋亡及加重衰老心肌缺血/再灌注损伤中的意义;第二,由于X染色体连锁的凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)是目前发现作用最强的线粒体后凋亡抑制蛋白,因此本研究还分析了衰老心肌表达下调的XIAP与促进心肌细胞凋亡,加重衰老心肌缺血/再灌注损伤的关系,并明确XIAP下降的原因是否与线粒体促凋亡蛋白Omi/HtrA2和Smac/DIABLO相关;第三,在确定了衰老心肌XIAP的下调与Omi/HtrA2相关后,本研究又进一步分析了Omi/HtrA2促衰老心肌细胞凋亡的机制和意义。本研究为加深对线粒体促凋亡蛋白信号转导途径在随年龄增加的心肌细胞凋亡中机制的理解,为寻找防治衰老性心脏疾病的有效分子靶点提供了实验依据。 研究方法: 1.建立成年及衰老大鼠心肌缺血/再灌注模型,通过观察血流动力学指标反映心功能状态,通过观察心梗面积、心肌细胞凋亡(Caspase活性及TUNEL方法)等心肌损伤指标,分析衰老大鼠对心肌缺血/再灌注损伤的敏感性;通过再灌注前给予凋亡抑制剂Z-VAD-FMK明确细胞凋亡在衰老心肌缺血/再灌注损伤中的贡献。 2.利用还原法测定成年及衰老大鼠心肌缺血/再灌注后心肌组织中Trx活性、TrxR活性;利用ELISA方法检测过氧亚硝基(ONOO-)水平;利用LDH清除法检测心肌组织中总的NO的含量;检测p-VASP及VASP蛋白水平,通过p-VASP/VASP比值反映NO得生物利用度;利用免疫共沉淀技术检测衰老大鼠心肌组织中的TrxR的硝基化水平;再灌注前给予ONOO-清除剂FeTMPyp,分析TrxR硝基化失活在促心肌细胞凋亡及加重衰老心肌缺血/再灌注损伤中的作用。 3.测定成年及衰老大鼠心肌缺血/再灌注后心肌组织中XIAP蛋白水平并分析其与再灌注损伤的关系;检测Omi/HtrA2、Smac/DIABLO蛋白及mRNA水平;分别提取心肌组织的线粒体成分及胞浆成分,分析Omi/HtrA2由线粒体转位入胞浆的含量。给予Omi/HtrA2抑制剂Ucf-101观察XIAP蛋白水平及衰老心肌缺血/再灌注损伤情况,明确衰老心肌组织中XIAP下降的原因。 4.分别构建线粒体Omi/HtrA2及胞浆Omi/HtrA2的质粒,并转入H9C2心肌细胞株中,经缺氧/复氧刺激后,检测线粒体中及胞浆中Omi/HtrA2蛋白水平及凋亡水平;并利用线粒体膜稳定剂抑制Omi/HtrA2转位,观察转染细胞的凋亡,明确Omi/HtrA2由线粒体转位胞浆的机制在促心肌细胞凋亡中的作用。 5.构建稳染Omi/HtrA2的H9C2心肌细胞株,并观察细胞凋亡水平,明确线粒体中Omi/HtrA2具有直接促进细胞凋亡的作用,并进一步检测稳转细胞株中的HAX-1蛋白水平,探讨线粒体中Omi/HtrA2促细胞凋亡的机制可能与HAX-1相关;观察稳转Omi/HtrA2的H9C2心肌细胞衰老水平。构建心脏特异性过表达Omi/HtrA2的转基因小鼠,采用超声的方法动态检测转基因小鼠的心功能,HE染色及Masson染色观察转基因小鼠心脏形态学改变,分析过表达Omi/HtrA2对在体心脏的影响。 研究结果: 1.与成年大鼠相比,衰老大鼠心脏对缺血/再灌注损伤的敏感性增加,表现为心功能下降更为明显,心梗面积增大及心肌细胞凋亡增加,主要表现为Caspase-9(线粒体凋亡途径)活性增加;给予广谱Caspase抑制剂Z-VAD-FMK可以明显改善衰老心肌缺血/再灌注损伤。以上结果提示,心肌细胞凋亡增加是衰老大鼠对心肌缺血/再灌注损伤敏感性增加的重要原因之一。 2.衰老大鼠心肌组织中TrxR活性明显下降,并且心肌缺血/再灌注后TrxR的活性进一步下降;而且,两年龄组大鼠心肌组织TrxR活性的差别在缺血/再灌注后进一步加大,但TrxR蛋白水平并未发生改变,提示有其它修饰方式参与了TrxR活性的调节;与成年大鼠相比,衰老大鼠心肌缺血/再灌注后过氧亚硝基(ONOO-)水平增加,硝基化TrxR的水平也同时增加,给予ONOO-清除剂FeTMPyp不仅能降低TxR硝基化,还恢复了TrxR的活性,减少了衰老大鼠心肌细胞凋亡,减轻了心肌缺血/再灌注损伤。以上结果提示,衰老大鼠心肌组织中增加的ONOO-可能通过硝基化失活TrxR,促进心肌细胞凋亡,加重衰老心肌缺血/再灌注损伤。 3.与成年大鼠相比,衰老大鼠心肌细胞中XIAP表达下降,心肌缺血/再灌注后心肌组织的XIAP下降更为明显;而且,心肌组织XIAP蛋白水平与心肌缺血/再灌注后心功能指标成正相关关系。以上结果提示,衰老大鼠心肌细胞中XIAP表达下降与衰老心脏对缺血/再灌注损伤敏感性增加相关。 4.衰老大鼠心肌组织中Smac/DIABLO的蛋白及mRNA水平与成年大鼠相比均未发生改变,但Omi/HtrA2的蛋白水平及mRNA水平均升高;与成年大鼠相比,衰老大鼠心肌缺血/再灌注后Omi/HtrA2由线粒体转位入胞浆增多;给予Omi/HtrA2特异性抑制剂Ucf-101,可以显著逆转XIAP的下降,改善衰老心肌缺血/再灌注损伤。以上结果提示,衰老大鼠心肌组织中增加的Omi/HtrA2,尤其是心肌缺血/再灌注后由线粒体转位入胞浆的增加,是衰老心肌组织中XIAP水平下降的重要原因,同时也是衰老心脏对缺血/再灌注损伤敏感性增加的原因之一。 5.以构建过表达线粒体Omi/HtrA2及胞浆Omi/HtrA2的H9C2心肌细胞为研究工具发现,与空载体组相比,无论是过表达线粒体或胞浆中Omi/HtrA2的H9C2细胞对缺氧/复氧处诱导的细胞凋亡敏感性均增加;利用线粒体膜稳定剂Cyclosphorine A(CsA)抑制Omi/HtrA2转位,发现CsA可以降低缺氧/复氧诱导的过表达线粒体Omi/HtrA2细胞凋亡,但是却不能改善过表达胞浆Omi/HtrA2细胞的缺氧/复氧损伤。以上结果提示,过表达Omi/HtrA2的转位增加机制在缺氧/复氧损伤中具有重要作用。 6.以构建稳转线粒体Omi/HtrA2的H9C2细胞系为研究工具发现,与空载体组相比,过表达线粒体Omi/HtrA2的H9C2细胞Caspase-3、8、9活性均增加,给予Ucf-101或者Z-VAD-FMK可以有效降低Caspase-3、8、9活性,但是给予线粒体膜稳定剂CsA则作用不明显,这提示增加的线粒体Omi/HtrA2具有直接促进心肌细胞凋亡的作用;同时我们还发现,过表达线粒体Omi/HtrA2可降低线粒体内抗凋亡蛋白HAX-1的表达,给予Omi/HtrA2的特异性抑制剂Ucf-101则可以增加HAX-1的表达,但对XIAP蛋白并未影响,这提示线粒体Omi/HtrA2促细胞凋亡机制可能与HAX-1降解有关。最后我们还发现过表达线粒体Omi/HtrA2可诱导H9C2细胞出现衰老样改变,表现为β-半乳糖苷酶阳性细胞数增加。 7.以构建心脏特异性过表达Omi/HtrA2的转基因小鼠为研究工具发现,与野生型小鼠相比,左心室收缩功能障碍(EF,FS值下降)、舒张功能障碍(E/A比值增加)、室腔变大、室壁变薄、心室胶原纤维增加。以上结果提示,过表达Omi/HtrA2可导致在体心脏结构及功能损伤。 结论: 1.衰老心肌组织中硫氧还蛋白还原酶的硝基化失活促进了衰老心肌细胞凋亡,加重了衰老心肌缺血/再灌注损伤; 2.衰老心肌组织中表达增加的Omi/HtrA2加重了心肌缺血/再灌注损伤。其机制可能有两种,一种是心肌缺血/再灌注后Omi/HtrA2由线粒体转位入胞浆增加,降解抑凋亡蛋白XIAP,促进心肌细胞凋亡;另一种是线粒体中增加的Omi/HtrA2降解抗凋亡蛋白HAX-I直接促进心肌细胞凋亡; 3.心脏特异性增加Omi/HtrA2的表达,不仅可以导致心功能障碍(在体),而且可以诱导心肌细胞出现衰老样改变(离体)。