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禽波氏杆菌是一种家禽新型细菌性疫病的病原菌，它和支气管败血波氏杆菌、百日咳波氏杆菌、副百日咳波氏杆菌同属于产碱杆菌科，波氏杆菌属。可造成鸡胚死亡、孵化率降低、死胚率增加，雏鸡的呼吸道症状及急性死亡。由于该菌既能够水平传播，又能够垂直传播，导致了该病代代相传，逐代扩大，给养禽业造成巨大的经济损失。目前对该病防控所采用的全菌体灭活疫苗存在着某些副作用，如局部非细菌性炎症、肉芽肿及降低生产性能等，亟待研发新型疫苗。OmpA是禽波氏杆菌最主要的免疫保护性抗原之一，具有被开发利用为亚单位疫苗的潜力。因此，本课题计划对禽波氏杆菌ompA基因进行原核表达和毕赤酵母真核表达，利用表达产物与泰山松花粉多糖佐剂构建成基因工程亚单位疫苗，以期为禽波氏杆菌的免疫防控提供新的技术支撑和理论依据。1.禽波氏杆菌ompA基因的原核表达设计引物，对实验室分离得到的禽波氏杆菌P5株的ompA基因进行PCR扩增，胶回收后连接到pMD-18T质粒，转化后测序。测序结果与NCBI发表的ompA基因（App1–597, NCBI GeneBank序列号:M96550.1）同源性为100%。将ompA基因连接到pET32a+表达质粒并转入E.coli BL21进行IPTG诱导表达，37℃，8h，产物蛋白以包涵体的形式进行高效表达。表达的ompA通过HIS标签镍柱层析法进行纯化，纯化蛋白的SDS-PAGE显示目的条带大小与预期相符，为47KD左右。Western blotting分析采用抗HIS标签的单克隆抗体作为一抗，采用DAB显色法进显色，可见约47KD大小的特异性条带，与SDS-PAGE分析相符。本研究为禽波氏杆菌亚单位疫苗的制备提供了物质基础。2.泰山松花粉多糖对禽波氏杆菌ompA原核表达产物在小鼠体内免疫反应的影响为研究泰山松花粉多糖(TPPPS)对禽波氏杆菌外膜蛋白A（ompA）基因工程亚单位疫苗在小鼠体内免疫反应的影响，将提取的泰山松花粉多糖与原核表达的ompA一定体积配比制成疫苗。雄性Balb/c小鼠随机分为6组，I-V组分别注射3个不同多糖剂量（200mg/kg、400mg/kg、800mg/kg）的ompA疫苗，弗氏佐剂-ompA和纯化ompA。在免疫后分七次检测抗体效价、白介素-2含量、CD4+和CD8+水平、T淋巴细胞转化率和小肠SIgA含量。结果显示，仅注射ompA不能刺激机体产生足够的抗体保护，泰山松花粉多糖和弗氏佐剂都能够提高小鼠针对ompA的体液免疫和细胞免疫反应。400mg/kg的松花粉多糖效果显著（p＜0.05），优于其他两个剂量的松花粉多糖和弗氏佐剂，且未造成任何的局部炎症反应和组织损害。松花粉多糖的研究为基因工程亚单位疫苗佐剂的研制和解决原核表达蛋白的低免疫原性提供了理论依据和技术支持。3.禽波氏杆菌ompA毕赤酵母表达设计一对引物，扩增禽波氏杆菌P5株的ompA基因，胶回收后克隆到pMD-18T载体进行测序。将ompA基因连接到表达质粒pPIC9质粒上，转化入DH5a扩增后，Licl化学转化法转入毕赤酵母GS115中，筛选阳性子进行双酶切鉴定，为Mut+型，甲醇诱导进行分泌表达，96h，收集培养上清，通过HIS标签镍柱纯化，然后进行SDS-PAGE分析，得到大小约为33KD的特异性条带。Western鉴定采用抗HIS标签的单克隆抗体做为一抗进行检测，通过ECL显色方法进行显色，得到单一的特异性发光条带。本试验旨在对原核病原菌的免疫保护基因的真核表达做出探索研究，为揭示禽波氏杆菌的致病机理和亚单位疫苗的开发奠定基础。