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N-乙酰神经氨酸（N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac）作为唾液酸最重要的形式之一,在人体发挥多种生物学功能。N-羟乙酰神经氨酸（N-gylcolylneuraminic acid,Neu5Gc）是唾液酸的另一种形式,被发现存在于癌症患者的血清、细胞、组织中,与癌症的发生发展密切相关。因此,人体在补充Neu5Ac的同时,应减少Neu5Gc的摄入。燕窝是Neu5Ac含量最高的天然物质,且不含有Neu5Gc,但由于价格高昂,不利于推广普及,寻找制备Neu5Ac的廉价来源意义重大。通过文献查阅以及高效液相色谱法（High-performance liquid chromatography,HPLC）检测预实验,发现鸡小肠中Neu5Ac丰富且不含Neu5Ac,因此本文以鸡小肠为原料研究其作为N-乙酰神经氨酸的生物资源的可行性。目的:探讨以鸡小肠为原料提取Neu5Ac的最佳工艺参数,Neu5Ac粗品纯化的最佳工艺参数,探讨制备的Neu5Ac体外抗炎作用的效果。为鸡小肠的开发再利用提供新思路。方法:（1）原料的处理,对收集到的鸡小肠进行匀浆、冻干、粉碎、过筛,制得鸡小肠冻干粉备用。参照国标方法,测定其蛋白质、脂肪、水分、灰分。（2）以Neu5Ac提取量为指标,先采用单因素试验,在几种提取Neu5Ac常用酸（盐酸、硫酸、柠檬酸、三氟乙酸、醋酸）中筛选最佳酸,进一步研究提取酸浓度（0.01、0.05、0.10、0.15、0.20mol/L）、提取时间（2、2.5、3、3.5、4、4.5 h）、液料比（10:1、20:1、30:1、40:1、50:1m L/g）3个因素对Neu5Ac提取量的影响。在单因素试验基础上,采用Box-Behnken试验设计方法,进行3因素3水平响应面优化设计,得到从鸡小肠中提取Neu5Ac的最佳工艺参数,并采用HPLC法对Neu5Ac粗提物进行初步鉴定。（3）采用乙醇沉淀除蛋白法初步纯化粗提物,采用离子交换层析法进行二次纯化。对离子交换树脂类型（732、D301、D201、201×7）、树脂添加量（1、2、3、4、5 g）、上样浓度（4.32、8.54、17.24、34.62 mg/m L）、上样流速（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 m L/min）、最大上样体积等因素进行优化,得到离子交换树脂二次纯化Neu5Ac的最佳条件。将纯化液冻干,复溶,用HPLC法测定待测液浓度,并采用液相色谱串联质谱法（liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS）检测Neu5Ac样品。（4）将Neu5Ac样品配制成0、0.1、10、25、50、100、200μg/m L,MTT法检测上述浓度干预对小鼠单核巨噬细胞RAW264.7（下称RAW264.7）活力的影响。其后用上述浓度干预RAW264.7,用脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）刺激RAW264.7产生炎症,检测上清液中一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白细胞介素6（interleukin-6,IL-6）、白细胞介素1β（interleukin-1β,IL-1β）、前列腺素E2（prostaglandin E2,PGE2）的含量。结果:（1）单因素试验结果显示:几种常见提取用酸释放Neu5Ac的能力大小依次为盐酸>硫酸>柠檬酸>三氟乙酸>醋酸,盐酸、硫酸、柠檬酸三者提取得到Neu5Ac的量相近,差异无统计学意义（P>0.05）,选取柠檬酸用于后续实验。当柠檬酸浓度在0.01～0.20mol/L范围内时,Neu5Ac提取率随着酸浓度的增加呈先增加后减小的变化趋势,当柠檬酸浓度为0.10 mol/L时,Neu5Ac提取量达到最大值。Neu5Ac提取量随提取时间的延长,呈先增高后降低的趋势,在提取时间为3.5 h时Neu5Ac提取量达到峰值。Neu5Ac提取量随着液料比的增大,呈现先增大后减少的趋势,当液料比30:1（m L/g）,Neu5Ac提取量最大。综上,提取Neu5Ac的最佳酸为柠檬酸,提取最佳条件为柠檬酸浓度0.10mol/L,提取时间为3.5 h,液料比30:1（m L/g）。（2）3因素3水平响应面优化试验,得到的回归方程为:Y（Neu5Ac提取量）=945.00-47.79A+99.63B+121.65C+25.05AB+108.47AC-64.43BC-47.90A2-25.12B2-132.62C2。模型的P值<0.0001,回归模型极显著,失拟项F值为0.25（P>0.05）,失拟项不显著,该回归模型的拟合程度良好,能较好解释响应的变异。比较各影响因素F值的大小,可确定三者对Neu5Ac提取量影响程度的大小依次为:液料比>提取时间>柠檬酸浓度。且柠檬酸浓度与液料比之间,提取时间与液料比之间存在交互作用（P<0.01）。响应面优化结果结合实际操作的简便,确定Neu5Ac提取的最佳工艺参数为:柠檬酸浓度0.10 mol/L,提取时间4 h,液料比30:1（m L/g）。在此条件下,经测定得到Neu5Ac提取量为（1010.39±21.87）μg/g,与预测值1025.69μg/g相近（P>0.05）。HPLC法测定结果表明,样品中含有Neu5Ac,未检出Neu5Gc。（3）实验结果显示,离子交换树脂通过吸附柠檬酸,分离柠檬酸与Neu5Ac。D301对柠檬酸的吸附率最大,同时对Neu5Ac的保留率最大,决定使用D301树脂用于后续实验。当不断增加树脂的用量时,柠檬酸吸附率也随之逐步上升。树脂添加量达到3 g时,此后柠檬酸吸附率上升趋势趋于平缓。柠檬酸吸附率随着柠檬酸浓度的增加,呈现先增大后减小的变化趋势。当上样液浓度为8.54 mg/m L时,树脂对柠檬酸的吸附率达到最大值。随着上样流速的逐渐增大,柠檬酸吸附率整体上呈逐渐减小的趋势。综合比较柠檬酸吸附率,结合分离花费时间,选取上样流速1.5 m L/min,作为后续分离实验的上样流速。泄漏曲线显示,当流出液体积为150 m L时,开始出现柠檬酸泄漏。在最佳纯化条件下,计算得到制备的样品中Neu5Ac含量为85.35%,LC-MS法测定结果显示,样品的理论相对分子质量与Neu5Ac标准品一致,未检出Neu5Gc。（4）Neu5Ac对LPS刺激的RAW264.7细胞抗炎作用研究:RAW264.7暴露于不同浓度Neu5Ac后,结果显示与空白组相比,0.1、10μg/m L组对RAW264.7细胞增殖有轻微刺激作用（P<0.05）,其他4组对RAW264.7活力无明显影响（P>0.05）。对细胞上清液中炎性介质检测结果显示:与LPS应激组相比,不同质量浓度的Neu5Ac能有效抑制NO的分泌,差异有显著性（P<0.05）,其中50μg/m L组抑制效果最为明显（P<0.05）。与LPS应激组相比,不同质量浓度的Neu5Ac能有效抑制TNF-α的分泌,差异有显著性（P<0.05）,各Neu5Ac处理组抑制效果相近（P>0.05）。与LPS应激组相比,不同质量浓度的Neu5Ac能有效抑制IL-6的分泌,差异有显著性（P<0.05）,其中50μg/m L组抑制效果最为明显（P<0.05）。与LPS应激组相比,不同质量浓度的Neu5Ac能有效抑制IL-1β的分泌,差异有显著性（P<0.05）,其中,50μg/m L组抑制RAW264.7炎症细胞分泌炎性因子IL-1β的效果最好（P<0.05）。与LPS应激组相比,不同质量浓度的Neu5Ac也能抑制PGE2的分泌,差异有显著性（P<0.05）,25、50、100、200μg/m L组抑制RAW264.7炎症细胞分泌炎性因子IL-1β的效果相近（P>0.05）。结论:（1）在单因素试验的基础上,结合响应面法优化了Neu5Ac提取工艺条件,得到Neu5Ac提取的最佳工艺参数为:柠檬酸浓度0.1 mol/L,提取时间4 h,液料比30:1（m L/g）。HPLC法初步鉴定,发现样品中唾液酸种类仅为Neu5Ac,未检出Neu5Gc。（2）Neu5Ac提取液纯化的最佳条件为:D301树脂,添加量3 g,柠檬酸初始浓度8.54mg/m L,上样流速1.5 m L/min,最大上样量150 m L。在此纯化条件下,样品中Neu5Ac含量为85.35%。采用LC-MS法进一步鉴定制备的Neu5Ac样品,验证了其中含有的唾液酸种类仅为Neu5Ac,未检出Neu5Gc。（3）不同浓度Neu5Ac对LPS刺激的RAW264.7细胞炎性介质NO、TNF-α、IL-6、IL-1β、PGE2的分泌均有抑制作用,但没有良好的剂量-效应关系,综合而言,Neu5Ac质量浓度为50μg/m L时,抗炎效果最佳。