马铃薯病毒快速检测体系的建立及马铃薯BRP1基因dsRNA的体外表达

来源 :青岛农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:hanlu198723620
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马铃薯病毒是造成马铃薯种质退化的主要原因,可造成马铃薯产量降低和品质下降。侵染马铃薯的植物病毒有40多种,其中PVY、PVS、PVM、PLRV等在田间生产中普遍发生,严重影响了马铃薯生产。目前,国内外主要通过生产马铃薯脱毒种薯来解决种质退化问题,这使马铃薯脱毒材料及种薯的病毒检测显得尤为重要,由此建立一套快速、有效的病毒检测方法迫在眉睫;PSTVd很难通过茎尖脱毒去除,通过PSTVd结合蛋白探究其在寄主体内的复制侵染是防控PSTVd的一个新思路。基于此,本研究开展了马铃薯主要病毒检测方法和PSTVd结合蛋白相关基因的dsRNA研究,主要取得结果如下:  1.克隆了青岛地区ToCV和PVM的CP基因,其核苷酸序列全长分别为774bp、915bp。Blast比对结果显示,ToCV青岛分离物与各分离物间CP基因序列的相似性为97.2%-99.6%,推导的氨基酸序列的相似性为97.3%-100%;PVM青岛分离物与各分离物间CP基因序列的相似性为79.0%-95.5%,推导的氨基酸序列相似性为84.5%-97.7%。  2.以感染PSTVd的植株总RNA作为模板,比较了一步RT-PCR方法与两步RT-PCR方法,表明一步RT-PCR检测技术具有快捷、简便、减少污染等优点。以此为基础,建立了马铃薯5种主要病毒(PVS、PLRV、PVY、PVM和ToCV)和1种类病毒(PSTVd)同时检测鉴定的一步六重RT-PCR技术,扩增得到目的条带大小分别为932bp、781bp、628bp、534bp、229bp和359bp。  3.克隆了PSTVd的马铃薯结合蛋白BRP1蛋白基因,ORF全长1809bp,含有191bp内含子,推导的氨基酸序列全长为602aa。其与番茄同源蛋白Virp1的氨基酸序列相似性在98%以上,其中核定位信号区域为100%、bromodomain结构域为97%、RNA结合区域为93%;构建了针对BRP1蛋白基因的1217bp BRP11的dsRNA原核表达载体和548bp BRP12的dsRNA体外转录体系,通过体外转录方法分别获得了1217bp和548bp的dsRNA。稳定性试验表明,得到的dsRNA比较稳定,可用于后期试验。  研究结果为马铃薯种薯病毒的快速检测鉴定提供了技术支撑,为马铃薯纺锤块茎类病毒的有效防治奠定了理论基础。
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