在生物荧光成像中,高保真度的荧光图像有助于研究者们获取关于靶标的准确信息,并有效地观察它们的变化。要想提高图像的保真度,提高探针的信噪比是一种很有效的方法。针对细胞膜或细胞内具有膜结构的细胞器,要想设计一个高信噪比的探针,粘度敏感型的分子转子是一种很好的选择。在非粘性或者低粘性的环境中,分子内旋转较快,这种旋转消耗了分子的激发态能量,导致强烈的荧光淬灭;当分子转子处于高粘度环境中,分子内旋转受限,降低了非辐射跃迁的可能性,则荧光恢复。而膜结构恰好可以提供一个高粘度环境。所以,只有当探针靶向膜时才能发光,未到膜上的探针则不发光。这样膜外分子的背景荧光大大降低,其信噪比大大提高。另外,通过设计得到具有双光子性质的红光发射的分子也是提高荧光探针信噪比的有效方法。在成像时,红光发射可以避免在蓝光/绿光区域细胞内的自发荧光,能够使背景噪音减到最小,从而提高探针的信噪比。在双光子激发下,尽管生物内源性荧光物质也会发出荧光,但是由于这些物质的双光子吸收截面值比较小,它们的荧光往往比较弱。因此,如果一个探针的双光子吸收截面值远远大于这些内源性荧光物质的,那么这个探针在利用双光子荧光显微镜时就可以给出一个高的信噪比。遗憾的是单光子激发和双光子激发遵循不同的选律,传统的单光子探针的双光子吸收截面太小以至于不能用于双光子荧光显微镜。针对这一现状,本论文主要设计合成具有转子性质的双光子红光探针用于高保真成像细胞器和RNA。首先,设计合成了双光子红光线粒体探针。活细胞内线粒体形态和数量时时刻刻都在变化,这种变化与各种损伤或者疾病息息相关,高保真度的荧光图像可以让人们有效地观察到它们的变化。但是目前双光子红光线粒体探针报道较少,且成像效果不是很好。在第二章中,本论文设计合成了 4种双光子阳离子盐化合物BCVPⅠ,BCVTⅠ,BCVⅡ和HJVPⅠ。其中改造经典转子DCVJ得到的HJVPⅠ比咔唑衍生物BCVPⅠ,BCVTⅠ和BCVⅡ转子性能要好,而且荧光发射相对来说较红。作为一个分子转子,HJVPⅠ在低粘度溶剂中单双光子荧光很低,而在高粘度甘油中单双光子荧光很强。高信噪比的HJVPⅠ可以在永生化细胞和正常细胞中高保真成像线粒体。HJVPⅠ与S-11348双染实验说明HJYPⅠ可以染色活细胞中的线粒体。另外,HJVPⅠ具有好的细胞膜通透性、低的毒性、好的光稳定性、大的斯克托斯位移以及与Hoechst 33342良好的兼容性等优点。这些良好的性能使得HJYPⅠ成为一个具有高信噪比的双光子红光线粒体探针。其次,设计合成了免洗型双光子红光细胞膜探针。细胞膜作为细胞的屏障在生物系统中起着至关重要的角色。它不仅可以通过选择性透过某些物质来保护细胞的完整性,而且与信号转导、细胞分化、细胞融合以及其他生物活性息息相关。对于活细胞,细胞在受到外界刺激时其形态会随之改变,而细胞膜的轮廓正是细胞形态的体现。轻微的刺激可能会引起细胞的形态甚至是生理变化,如洗涤。洗涤可以改变细胞内的环境,影响活细胞的生理和结构完整性,就算洗涤也不能把未和靶标结合的探针全部洗出。另外,虽然现代医学比较发达,但是有些疾病人们还只是停留在研究阶段。这就需要冰冻组织(可长时间保存)来研究,在研究的过程中如果有特定的探针标出细胞膜,即标出细胞的边缘,这样有利研究者定位研究。但是目前标记固定细胞或组织中细胞膜的探针甚是缺乏。在第三章中,本论文设计合成了 4种双光子化合物BCVOPⅠ,BCVOⅡ,ASOPⅠ-1和HQVOPⅠ。基于经典转子的红光ASOPⅠ-1和HQVOPⅠ不但保持着转子性质,而且具有双光子性能,可以直接标记活细胞、固定细胞和组织中的细胞膜,染色过程可以免洗。再次,设计合成了免洗型双光子红光RNA探针。RNA作为生物细胞的遗传信息中间载体,不但参与蛋白质的合成,还参与基因表达调控。RNA对生物体的重要性不言而喻。与前面提到的线粒体和细胞膜探针相比,基于小分子的RNA探针报道的非常少,更不用说双光子红光的RNA探针了。目前合成RNA探针的难点是:(1)与核酸结合的小分子更易结合DNA;(2)细胞中的蛋白质和膜干扰RNA探针的结合专一性;(3)结合机理不清楚。目前报道的共18种RNA探针,其中有3种探针只能在死细胞中成像RNA,而其他15种探针虽然能在活细胞中成像RNA,但是有些探针孵育时间长达12 h。在这些报道的探针中,所有探针在染色后都需要洗涤步骤。我们知道对于细胞来说,轻微的刺激可能会引起细胞的形态甚至是生理变化,如洗涤。所以,在第四章中本论文设计合成了一种免洗型的RNA探针。具有良好转子性质的MOBTⅠ通过简单孵育20 min就可以进入SiHa,HeLa和BMSC细胞中,无须洗涤可直接到共焦显微镜和双光子荧光显微镜上观察3种细胞内的RNA。无论是收集绿光还是红光,都可以清楚的看到细胞内RNA的分布情况。而且MOBTⅠ无论是在单光子成像还是双光子成像是都比商业化的探针SYTO RNA-Select表现出强的耐光性。最后,设计合成了探测线粒体膜电位的免洗型双光子红光探针。线粒体膜电位(MMP)是代表线粒体功能的一个很重要的参数。它的降低意味着线粒体电子运输链的破坏,这会导致细胞的功能紊乱甚至是死亡。因此,MMP不同状态的反馈,如正常、降低和消失,对于生物医学研究和相关疾病的诊断尤其有用。到目前为止,主要有两种探针:(1)荧光强度探针(例如罗丹明123,TMRE和TMRM),但是这些探针仅用荧光成像很难区分MMP降低或者消失。(2)荧光比色探针(例如JC-1),在每次实验之前JC-1的染色浓度需要重复调试,当用低浓度染色时,很难形成J聚集;而高浓度由于水溶性较差又会形成块状沉淀,这将为测试带来极大的不便。正如前几章介绍的一样,洗涤会影响细胞的状态,甚至是生理特征,这样会影响MMP,给测试结果带来一定的误差。在第五章中,本论文设计合成了两个双光子红光阳离子盐化合物HMOBTⅠ和ASHTⅠ。两种化合物具有良好的转子特性,在染色细胞的时候可以免洗。当MMP变化时,HMOBTⅠ和ASHTⅠ可以从线粒体分别靶向RNA或者核酸(NA)。这样通过细胞内的荧光位置变化可以轻易地看到MMP的变化。具有转子特性的两种化合物在染色细胞时无需洗涤,可以给出MMP变化的准确信息。综上,本论文设计合成了一些双光子红光探针用来高保真成像细胞器及RNA。基于转子的这些探针在染色细胞的时候可以免洗,不但减少了对细胞的伤害,而且可以给出靶标的准确信息,尤其是像线粒体和细胞膜这种形态时时刻刻都在变化的细胞器。这为实现线粒体探针,细胞膜探针以及RNA探针商业化奠定了基础。