本研究设计单链monellin 基因，利用大肠杆菌表达系统，构建高表达的Monellin 重组大肠杆菌工程菌，从而提高Monellin 的稳定性；并用乳糖代替IPTG 作为诱导剂，以降低生产成本。同时对两种载体（pET22b 和pET28a）构成的大肠杆菌表达系统的表达效果进行了比较。 1.根据monellin 基因的序列，按照Coden Usage Database 数据库（NCBI-GenBank）中大肠杆菌密码子的偏爱性，人工设计并合成monellin基因。并在合成基因的5’端添加NcoⅠ酶切位点，在基因的3’端添加BamHⅠ酶切位点，将合成好的全基因通过NcoⅠ/BamHⅠ位点克隆到pET22b载体上。构建重组载体pET22b-Mon，将重组载体转化大肠杆菌BL21（DE3），得到表达monellin的大肠杆菌工程菌株DE3-pET22b-Mon。再用NcoⅠ、BamHⅠ从含甜蛋白monellin基因的pET22b上切下monellin基因，并将其插入到pET28a 的NcoⅠ、BamHⅠ位点之间，构建重组载体pET28a-Mon，将重组载体转化大肠杆菌BL21（DE3），得到表达Monellin的大肠杆菌工程菌株DE3-pET28a-Mon。 2.以摇瓶发酵为基础，探讨了不同载体构成的大肠杆菌工程菌在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导下的表达，研究了诱导起始生长量、诱导培养温度、诱导培养时长及接种量对目的蛋白表达的影响。 对于大肠杆菌工程菌株DE3-pET22b-Mon，其诱导优化条件如下：在装液量为20mL/100mL摇瓶中，按1％的接种量接种，当OD600值达到0.73 时，添加诱导剂IPTG至终浓度为1.0mmol/L，37℃继续培养6h后，Monellin的表达量达到细菌总蛋白的22.26％。 对于大肠杆菌工程菌株DE3-pET28a-Mon，其诱导优化条件如下：在装液量为20mL/100mL摇瓶中，按1％的接种量接种，当OD600值达到1.0 时，添加诱导剂IPTG至终浓度为1.0mmol/L，37℃继续培养6h后，Monellin的表达量高达细菌总蛋白的34.08％。 3.以摇瓶发酵为基础，探讨了不同载体构成的大肠杆菌工程菌在乳糖诱导下的表达，研究了诱导剂浓度、诱导起始生长量、诱导培养温度、诱导培养时长及接种量对目的蛋白表达的影响。 对于大肠杆菌工程菌株DE3-pET22b-Mon，其诱导优化条件如下：在装液量为20mL/100mL摇瓶中，按3％的接种量接种，当OD600值达到1.0 时，添加诱导剂乳糖至终浓度为10g/L，37℃继续培养7h后，Monellin的表达量占细菌总蛋白的19.86％。 对于大肠杆菌工程菌株DE3-pET28a-Mon，其诱导优化条件如下：在装液量为20mL/100mL摇瓶中，按3％的接种量接种，当OD600值达到1.0 时，添加诱导剂乳糖至终浓度为11g/L，37℃继续培养8h后，Monellin的表达量占细菌总蛋白的33.09％。 4.在摇瓶发酵的基础上，以DE3-pET28a-Mon为研究对象，选用终浓度为11g/L的乳糖作为诱导剂，采用5L的发酵罐进行小试。发酵终产物OD600=6.02，菌体湿重=18.5g，得到的纯化Monellin为0.06g。性质较天然Monellin有显著改善：中性条件下，60℃下保温50min仍具有强烈的甜味，70℃保温5min仍有甜味；在pH=3，50℃下仍有甜味。