第一章 螺旋神经节细胞分离和培养方法的建立 目的 听觉神经元的损伤是感音神经性耳聋的主要原因之一。近年来研究表明听觉神经元损伤多与自由基特别是氧自由基有关。以前的研究大多停留在体内实验阶段，而细胞培养允许我们对发生在细胞及分子水平的最基本的机制进行研究，但由于耳蜗螺旋神经节细胞(spiral ganglion cells，SGCs)数量有限且不增殖，取材困难，导致其培养技术远不如其他细胞培养技术发展迅速和成熟。耳蜗SGCs的离体培养无疑将为体外研究听觉神经元的氧化损伤机制及其防治方法提供更直接的研究手段。本研究旨在探讨离体SGCs的短期培养方法，并为进一步研究提供实验模型和基础。 方法 以出生1～3天的昆明小鼠为研究对象，在无菌条件下取出耳蜗，置于Hanks平衡盐溶液(Hank’ balanced salt solution，HBSS)中，解剖显微镜下去除蜗壳、螺旋韧带及基底膜，保留仅含螺旋神经节的蜗轴螺旋管(Rosenthal’s canal)。HBSS洗涤3次，0.125％胶原酶(collagenase)37℃下消化20分钟后加入0.125％胰酶(trypsogen)继续消化15分钟，加入DMEM／F-12培养基(DMEM：F-12=1：1，含10％胎牛血清)终止消化，1000rpm离心7～10分钟，去除上清，加入DMEM／F-12高糖培养基，巴斯德吸管反复轻轻吹打，充分混匀，血细胞计数板计数，以1.0×10~5／mL密度接种于经多聚赖氨酸(poly-lysine)处理后的96孔培养板或6孔板。培养基中加入100U／mL青霉素以抑制微生物生长，加入胰岛素10μg／mL促进神经细胞生长，阿糖胞苷(cytosine arabinoside，Ara-C)(5μmol／L)抑制非神经细胞生长。每日半量换液，并于倒置显微镜下观察细胞生长情况，照相保存，培养24小时后开始实验，培养24～48小时后用神经元特异性烯醇化酶抗体(rabbit anti-neuron-specific enolase，anti-NSE)按链霉卵白素-过氧化物酶(streptavidin-peroxidase，SP)程序进行免疫细胞化学鉴定。 结果 在培养条件下SGCs生长良好，SGCs约在接种后半小时开始贴壁，成纤维样细胞在接种后先于SGCs完成贴壁过程，SGCs贴壁后不久可见小的突起伸出，24小时后可见典型的双极神经元(bipolar neuron cells)，极少数呈三极神经元(tri-polar neuron cells)。培养24～48小时后用NSE抗体按SP程序鉴定，SGCs全细胞着色，DAB显色为棕黄色，但有仅胞体染色者。 结论 耳蜗SGCs可成功进行体外培养，DMEM／F12是SGCs的良好培养基，Arac抑制非神经细胞生长是SGCs筛选的有效方法。培养SGCs的数量和活性可满足各种实验需要，是研究听觉神经元生理和病理过程的良好材料。SGCs的成功培养为进一步研究提供了实验模型和基础。