论文部分内容阅读
目的:1.了解大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性及归巢特征;2.通过重组腺病毒介导的人肝细胞生长因子基因转染骨髓间充质干细胞,探讨其转染效率、目的基因的表达情况;3.探讨携带有肝细胞生长因子基因的骨髓间充质干细胞对移植颗粒脂肪的新生血管和存活率的影响。方法:1.采用密度梯度离心法分离、培养、扩增骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞增殖周期,传代后的细胞成脂诱导。用Ad-GFP转染第3代MSCs,25只Wistar大鼠随机分为延迟复苏组（A组,10只）、即时复苏组（B组,10只）、假烫组（C组,5只）;A、B两组大鼠背部造成Ⅲ度30%烫伤,制备A组为延迟复苏模型,B组为即时复苏模型,同时制备C组为假烫模型,经股静脉移植转染Ad-GFP48h后的MSCs;24h,7d后取小肠、肝脏、肾脏、烫伤皮肤创缘等组织,快速冰冻切片,荧光显微镜下观察在体内的分布。2.取第3代大鼠MSCs,以不同感染强度（MOI）（50,100,150,200）的Ad-GFP转染MSCs,转染后的48小时,流式细胞仪检测转染效率,筛选最佳感染强度。Ad-HGF以最佳感染强度转染MSCs,ELISA法检测培养上清中HGF的表达。3.Wistar雌性大鼠150只,随机分为五组:A组颗粒脂肪1ml+0.4mlDMEM-LG;B组颗粒脂肪1ml+0.4mlDMEM-LG+1×108pfuAd-HGF液;C组颗粒脂肪1ml+0.4mlDMEM-LG+1×106 MSCs;D组颗粒脂肪1ml+0.4ml DMEM-LG+1×106 MSCs（携带GFP基因）;E组颗粒脂肪1ml+0.4ml DMEM-LG+1×106 MSCs（携带HGF基因）均匀震动5分钟,移植于背部皮肤与肌肉之间。移植后3d、5d、7d、14d、28d、60d每组各取5只脱颈处死,沿被膜分离出移植物,测体积,并行HE、masson’s染色观察病理改变,免疫组化法测定组织的HGF、CD34表达水平。结果:1.MSCs体外分离培养扩增5代,细胞数可达（1～2）×1011个,表现为成纤维细胞样外观和贴壁生长特性,细胞周期分析表明:Go/G1期细胞占79.3%,S+G2+M期细胞为21.7%,分离的细胞可以在诱导体系下向脂肪细胞分化;经股静脉移植携带GFP基因的MSCs,24h后观察,在延迟复苏组烫伤皮肤组织创缘,小肠黏膜广泛可见绿色荧光,而肝、肺等器官少见,即时复苏组荧光以烫伤皮肤创缘分布为主,小肠黏膜较少,假烫组中绿色荧光分布以肝脏为主。延迟复苏组小肠荧光强度明显强于即时复苏组和假烫组（P＜0.05）,而延迟和即时复苏组皮肤创缘荧光强度又强于假烫组（P＜0.05）。2.在Ad-GFP转染MSCs48小时,GFP的表达明显增强,荧光显微镜观察可见明显的绿色荧光,分别用不同的效价转染细胞,48小时后流式细胞仪测定转染率,结果显示,病毒强度MOI=100时转染率最高达86.4%;转染HGF后MSCs对HGF表达48h达到高峰,以后随时间开始降低。3.Ad-HGF转染MSCs组的移植体中HGF表达3d呈强阳性,随移植时间延长逐渐减弱,并且3d、5d、7d、14d表达明显强于其他组（P＜0.05）,而28d、60d时与其他组相比没有统计学意义（P＞0.05）;Ad-HGF转染MSCs组新生血管7d左右达高峰,14d后趋于平稳,在5d、7d、14d、28d、60d血管数量多于其他组（P＜0.05）。28d和60d时,Ad-HGF感染MSC组颗粒脂肪体积保持率明显好于其他四组（P＜0.05）。结论:1.骨髓间充质干细胞体外能向成脂分化;导入目的基因不会改变MSCs归巢特性;2.重组腺病毒可介导肝细胞生长因子基因转染骨髓间充质干细胞,有效表达目的蛋白;3.携带HGF基因的MSCs,在移植体中持续表达HGF,有效的促进移植颗粒脂肪的新生血管形成;减少颗粒脂肪移植后坏死、吸收,从而提高移植脂肪的存活率。