[目的] 构建人canstatin重组分泌型真核表达载体,转染CHO-K1细胞,初步鉴定该细胞培养液抑制血管生成的活性。 [方法] 用RT-PCR方法从新鲜人胎盘脐带组织中钓取canstatin全编码区cDNA。将该片段重组入pUCm-T克隆载体中,重组载体经限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列分析。从pUCm-T/canstatin克隆载体中,将人canstatin cDNA亚克隆入分泌型真核表达载体pSecTag2B,构建含人canstatin cDNA的重组质粒pSecTag2B/canstatin。将该重组质粒瞬时转染中国仓鼠卵巢(CHO-K1)细胞72h后,分别离心收集细胞和上清液,应用RT-PCR检测细胞中canstatin基因的表达,SDS-PAGE电泳检测转染后细胞和上清液中重组融合蛋白的表达,并用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验初步鉴定其生物学活性。 [结果] 成功获得684 bp人canstatin基因,测序证明canstatin cDNA编码序列与Genbank中报道的序列一致。成功构建人canstatin cDNA分泌型真核表达载体pSecTag2B/canstatin,将此重组质粒瞬时转染CHO-K1细胞,RT-PCR证实质粒pSecTag2B/canstatin已成功转染进入CHO-K1细胞。离心收集转染72h后的细胞和细胞上清液,在SDS-PAGE凝胶上均显示出一条约30kD的融合蛋白条带,与推测的蛋白大小相近,且细胞上清液中此蛋白条带较细胞内更明显。该细胞上清液在体内能抑制鸡胚绒毛尿囊膜中微血管的生成,实验组鸡胚绒毛尿囊膜颜色苍白,微血管生长减慢,数目稀少,血管轮廓模糊不清;对照组鸡胚绒毛尿囊膜颜色红润,微血管生长活跃,数目明显增多,血管轮廓清晰可见。 [结论] 1、成功构建了重组克隆载体pUCm-T/canstatin和分泌型真核表达载体pSecTag2B/canstatin。