目的:肌腱细胞培养是研究肌腱细胞增殖及分泌的基础,是研究术后肌腱粘连机制的重要途径。本实验以来亨鸡为研究对象,培养及鉴定肌腱细胞,观察肌腱细胞的生长规则及形态,快速、优质的获得肌腱细胞,为肌腱细胞的转染及移植提供优质的肌腱细胞。方法:细胞培养及传代:取来亨鸡14只,体重1～1.5kg,无菌条件下分离肌腱,显微镜下剪除肌腱外膜组织,用0.25%胰蛋白酶及0.1%胶原酶将整段肌腱在37℃消化30分钟后将肌腱剪成1mm3大小的碎块,再用上述浓度的胰蛋白酶及胶原酶混合液在37℃消化1小时。终止消化后100目滤网过滤去除碎块,滤液经800r/min离心10分钟,弃去上清液,经细胞计数后将细胞密度调整调至1×105个/ml,接种于培养瓶中培养,细胞贴壁后每三天换液一次,培养条件为37℃恒温,5%CO2浓度,饱和湿度。当肌腱细胞贴满培养瓶底80%-90%后进行细胞传代培养,吸出培养液,D-Hanks液洗涤3次,用0.125 %胰蛋白酶消化贴壁细胞,观察细胞周围变亮、变圆后终止消化,吸出消化液,加入培养液反复吹打至细胞离壁,细胞均匀悬浮后按1∶2分瓶传代培养。细胞贴壁时间观察:取10个一次性培养皿,分成原代组和传代组,每组5个,将原代、传代(第二代为例)肌腱细胞悬液分别移至一次性培养皿中,放入培养箱中培养,每30分钟在显微镜下观察细胞一次,当显微镜下轻轻挪动培养皿,大多细胞不再随培养液移动时,此即为肌腱细胞贴壁时间;之后细胞在培养皿底延展、分裂、增殖,当细胞增殖贴满培养瓶皿80%-90%时为细胞贴壁生长时间。记录10个培养皿中肌腱细胞贴壁时间、细胞贴壁生长时间,求其平均值。细胞形态学观察:取第二代细胞消化脱落后离心成团,用2.5 %戊二醛固定24小时,再用1%锇酸固定2小时,以50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇、90%乙醇-90%丙酮(1:1)、90%丙酮、100%丙酮梯度逐级脱水,每级15分钟,用Epon812环氧树脂包埋细胞,固化后修块定位,用超薄切片机切片50-60 nm,3%醋酸铀-枸橼酸铅双重染色,置透射电镜下观察。细胞生长曲线图绘制:4%甲醛分别固定1—15天内贴壁的原代肌腱细胞、1-8天的传代肌腱细胞(第二代),加入0.3%Fitonx-100、5%山羊血清,封闭45分钟,Hochest染色细胞核,300倍荧光显微镜下观察、计数视野中细胞核个数,绘制原代及传代肌腱细胞生长曲线。细胞鉴定:取第二代肌腱细胞悬液,接种于一次性培养皿,待细胞贴壁延展后吸出培养液,用4%甲醛固定肌腱细胞,用PBS液冲洗后,在细胞中加入0.3%Fitonx-100、5%山羊血清,封闭45分钟;吸出封闭液,吹干固定好的肌腱细胞;将培养皿底部划分、标记成四部分:一部分为Ⅰ型胶原组,一部分为纤维连接蛋白组,另两部分分别为Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白的对照组;在培养皿底部的Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白部分相应加入一抗,对照组加PBS液,放入4℃冰箱中过夜;复温后将培养皿移至暗室,在培养皿底部的四个部分相应加入二抗,放置于37℃培养箱中培养30分钟,加入40μmol/ml的Hochest染色细胞核,20秒后吸出,用PBS液漂洗三次,最后加入PBS液在荧光显微镜下观察、采图。结果:消化法培养肌腱细胞成功率为95 %,细胞不易污染,易于观察;原代肌腱细胞贴壁时间平均为6.2小时,传代肌腱细胞贴壁时间平均为5小时;原代细胞贴壁生长时间平均为11天,传代后细胞贴壁生长时间平均为5.4天;细胞传至第五代时细胞贴壁不牢,生长增殖缓慢。依原代及传代细胞生长曲线图可见:原代肌腱细胞在最初1-5天生长增值缓慢;在5-11天时细胞生长增值迅速,成对数生长;11天后细胞生长增值有所减缓;传代肌腱细胞在最初1-5天时细胞生长增值迅速,成对数生长;5天后细胞生长增值减缓。电镜下肌腱细胞呈长梭形,细胞体积较大,细胞核呈椭圆形,核仁呈网状结构,清晰可见,核周边有波浪状切迹;细胞质内有较丰富的粗面内质网,含有少量脂滴,大量的空泡状结构,较少的线粒体,高尔基体少见。荧光显微镜下Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白显色为阳性,而对照组显色为阴性。结论:经细胞鉴定所培养细胞为肌腱细胞;消化法培养细胞能快速获得肌腱细胞,传至二、三代的肌腱细胞是最优质的肌腱细胞,为更加深入的研究肌腱细胞的分泌表达及肌腱粘连的机制奠定了基础。