系统性红斑狼疮（Systematic lupus erythematosus，SLE）、类风湿性关节炎（Rheumtoid arthritis，RA）及强直性脊柱炎（Ankylosing spondylitis，AS）作为复杂的自身免疫性疾病，发病机制一直都不十分清楚。最近研究发现，在B细胞向浆细胞分化的过程中，浆细胞的发育和存活依赖于完整的非折叠蛋白反应（Unfolded protein response，UPR），而SLE以B细胞过度活化导致不恰当的自身抗体产生为特征；内质网（Endoplasmic reticulum，ER）应激可引起细胞凋亡及凋亡小体的产生，而自身免疫的抗原性物质则是核小体，后者是细胞凋亡小体的成分。因此推测ER应激可能参与了自身免疫疾病的调节。为了证实这一假设，我们通过观察病人和模型动物UPR通路相关基因的表达来证明SLE、RA存在ER应激；利用siRNA技术确定与疾病相关的UPR通路关键分子；通过比较T、B淋巴细胞对ER应激的敏感性，了解诱导自身抗体产生的主要抗原来源；通过在SLE及RA中检测到UPR基因表达的异常，发现对SLE和RA有着鉴别诊断意义的基因。这些研究有利于进一步了解非免疫机制在自身免疫疾病中的调节作用，为自身免疫疾病的发病机制研究及临床治疗提供新的思路和药物靶点。目的：本研究的目的是通过检测SLE、RA及AS外周血白细胞中UPR基因的表达，分析上述疾病中是否存在ER应激，并明确参与疾病调节的UPR通路关键分子；同时通过比较T、B淋巴细胞对ER应激的敏感性，来了解自身抗原物质的来源，以便更好地了解自身免疫疾病的发病机制。方法：通过实时荧光定量PCR检测SLE、RA及AS病人外周血白细胞ER应激相关基因的表达来证明SLE、RA及AS中是否存在ER应激；并且利用siRNA技术确定与疾病相关的UPR通路关键分子；使用ConA、LPS活化T淋巴细胞，并加入tunicamycin诱导小鼠产生ER应激，使用RT-PCR检测细胞ER应激相关基因的表达。结果：1.临床样本收集对于确诊的SLE、RA、AS患者，首先告知患者并签署知情同意书。收集确诊的患者和年龄匹配的正常对照各60余例，取患者及正常对照人外周抗凝血，新鲜分离白细胞，用于体外培养和提取RNA。2.使用SYBR GreenⅠ进行全定量PCR方法的建立作为基因表达定量检测标准品的重组质粒构建成功，经酶切及测序鉴定，各目的基因片段已插入pMD-19T载体；所建立的实时定量PCR方法的最低检测限为104个拷贝/反应，在起始模板量106~1013拷贝范围内，Ct值（荧光信号达到设定阈值所经历的循环数）与起始模板浓度具有良好的线性关系，r2=0.9919。3. UPR通路分子在SLE、RA、AS外周血白细胞中的表达通过定量PCR检测发现，ATF6、XBP1、MANF在SLE患者外周血白细胞中的表达上调，CHOP、PERK、IRE1表达下调。同时，MANF在RA患者中上调显著，但ATF6和XBP1表达显著下降。在AS患者中UPR通路各个基因表达均下降，MANF表达明显增高，提示了MANF可能参与了自身免疫疾病调节作用，ATF6及XBP1可以作为SLE及RA鉴别诊断指标。4. ATF6-siRNA的设计及在EL4细胞中的表达应用RNAi技术对EL4细胞中ATF6的转录进行沉默，转染siRNA后24hrs提取总RNA。RT-PCR结果显示，三条siRNA中有1条沉默有效，遂选取此条siRNA进行后续实验。ATF6基因被有效沉默后，细胞再次受到ER应激刺激后的反应发生了明显变化。5. T、B细胞的激活可诱导ER应激使用ConA、LPS分别活化T、B淋巴细胞，然后加入Tunicamycin诱导小鼠产生ER应激。PCR检测ER应激相关基因表达。结果发现T细胞中BIP、ATF6、IRE1、PERK表达均较B细胞低，而CHOP及XBP1表达上调，提示B细胞ER应激的反应性高于T细胞，T细胞可能存在ER应激功能紊乱。结论本研究所建立的ER应激基因mRNA的SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法适用于对人外周血大量样本的检测。ER应激可能参与了SLE、RA的疾病调节，B细胞ER应激的反应性高于T细胞。