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乳腺癌是全世界女性最常见的肿瘤,大约占全部肿瘤病例的20%。乳腺癌具有高度异质性,侵袭、复发及转移仍是其主要致死原因,在女性癌症相关死亡主因中位居第二。虽然已有大量针对乳腺癌的研究,但其病因及分子机制仍未完全清楚。本研究组在前期工作中发现FLI-1在恶性血液系统疾病中发挥着癌基因的作用。近十几年来,陆续有报道表明FLI-1还可参与某些实体瘤的发生。然而,对于FLI-1在乳腺癌中的生物学功能及其分子机制知之甚少,本研究旨在探讨FLI-1与乳腺癌的发生、发展及其侵袭、转移等恶性表型的相关性,以期揭示其内在的分子机制,为未来的乳腺癌治疗提供寻找新的靶标的分子基础。研究背景:FLI-1原癌基因(Fli-1 Proto-Oncogene,ETS Transcription Factor,FLI-1)是E26 transformation-specific(Ets)转录因子家族中的一员,定位于染色体11q24,最早由Ben-David Y等在Friend鼠白血病病毒(Friend Murine Leukemia Virus,F-Mu LV)诱导的小鼠红白血病细胞中发现。FLI-1在造血细胞、血管内皮细胞、胚胎组织和某些肿瘤组织中高表达。FLI-1作为转录因子,可通过识别、结合多种启动子或增强子的序列特异性DNA于转录水平上发挥其生物学功能,如血细胞形成和血管新生。此外,还可通过与多种蛋白相互作用来实现其生物学功能,如GATA1、BRCA1和SMAD3等。本课题组在前期工作中已经发现FLI-1在红白血病细胞系中可促进细胞增殖、抑制细胞凋亡,发挥了癌基因的功能。至于实体瘤方面的研究,从最早的儿童Ewing’s肉瘤,到后来我们团队和其他课题组陆续发现FLI-1在子宫内膜癌、卵巢癌、黑色素瘤、鼻咽癌、胶质母细胞瘤等中均呈现高表达,且其异常表达与肿瘤的增殖、侵袭、转移等表型关系密切,常常提示预后不良,可作为潜在的治疗靶标。上述研究均提示FLI-1与肿瘤进展及转移有关,然而FLI-1在乳腺癌中的具体生物学功能及其分子机制尚未得以阐明,迫切需要进一步深入研究。研究目的:1.分析FLI-1与乳腺癌临床病理特征的相关性。2.评估FLI-1在乳腺癌中的生物学功能:增殖、凋亡、侵袭、EMT及干细胞特性。3.探讨FLI-1行使其生物学功能的分子机制。研究方法:(1)利用组织芯片通过免疫组织化学染色方法分析FLI-1在乳腺癌中的表达情况,用相应的统计学方法分析FLI-1与乳腺癌的临床病理特征及预后的相关性。(2)应用si RNA对FLI-1进行瞬时干涉,用MTT法、细胞计数、流式细胞术、transwell实验和平板克隆形成实验评估FLI-1对细胞增殖、细胞周期、凋亡、迁移及克隆形成能力的影响。(3)构建FLI-1过表达及病毒包装干涉质粒,应用Western blot检测上皮-间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)相关标志物,并应用干细胞球形成实验及Western blot检测干细胞标志物评估干细胞特征。(4)构建稳定干涉FLI-1的MDA-MB231细胞系,给予裸鼠原位脂肪垫注射,从动物水平研究FLI-1对裸鼠成瘤能力的影响。(5)应用GST pulldown、Co-IP(Co-Immunoprecipitation)、双荧光素酶报告基因实验、Western blot、RT-PCR等方法对分子机制进行探讨。研究结果:本研究从组织、细胞、动物和分子等四个维度上进行了FLI-1的功能研究。1.在组织水平上,FLI-1表达水平与肿瘤的AJCC分期及淋巴结转移呈正相关;在HER-2过表达型及TNBC亚型中明显高表达,且与总生存期及无病生存期负相关。2.在细胞水平上,FLI-1在转移性乳腺癌细胞系中高表达,在非转移性细胞系中低表达,通过干涉FLI-1表达可抑制乳腺癌细胞增殖、促进凋亡、细胞周期阻滞于G0/G1期、降低黏附、侵袭及克隆形成能力。FLI-1可诱导乳腺癌细胞EMT的发生并维持癌细胞的干细胞特征。3.在动物水平上,FLI-1促进裸鼠脂肪垫原位成瘤能力,瘤体大小、重量及增殖指数(Ki-67 Index)免疫组化染色分析结果在体内水平进一步验证了FLI-1可促进细胞增殖及肿瘤形成。4.在分子水平上,一方面,FLI-1可作为转录因子直接同过其ETS区特异性结合mi R-17-92基因簇的启动子,通过活化mi R-17-92基因簇并影响mi R-17-92基因簇下游靶基因P21和Bim,促进乳腺癌细胞增殖、抑制凋亡;另一方面FLI-1能够影响Rho GDI,活化Rho家族中的Rho A、Rac1和CDC42,参与激活Rho GTPase信号通路,还可影响AKT的磷酸化水平。研究结论:1.FLI-1可作为判定乳腺癌预后的独立因素;2.FLI-1可发挥着促进乳腺癌细胞增殖、克隆形成、黏附能力、侵袭能力,抑制细胞凋亡,并可诱发EMT并维持干细胞特性的生物学功能;3.FLI-1可通过多种信号通路发挥其生物学功能,一方面通过上调mi R-17-92基因簇发挥促进增殖及抑制凋亡的作用,另一方面影响Rho A/Rac1及AKT信号通路。本研究揭示了FLI-1在乳腺癌发生发展过程中发挥着促癌作用并发现了其发挥作用的分子机制,为从分子机制水平寻找到靶向药物,降低转移和耐药的发生,为精准治疗乳腺癌提供夯实的分子基础。