论文部分内容阅读
目的：研究miR-377调节DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase1)的表达在人皮肤成纤维(Human skin fibroblasts, HSF)衰老中的作用及机制。方法：1.构建皮肤成纤维细胞复制性衰老模型(n=8)(年青组：p3-5,年老组：p25-30),免疫印迹法(Western-Blot)检测人皮肤成纤维细胞传代衰老模型中DNMT、Sirtl等蛋白的表达,并检测衰老相关p-半乳糖苷酶的活性。2.利用DNMT1siRNA抑制人皮肤成纤维细胞中DNMT1的表达,免疫印迹法(Western-Blot)检测DNMT1、Sirtl等指标的改变,检测衰老相关p-半乳糖苷酶的活性。3.生物信息学网站预测可能与DNMT1的3’UTR区域结合并调控DNMT1的miRNA,初步确定为miR-377能与DNMT1的3’UTR区域结合,可能调控DNMT1的表达。4.使用实时定量PCR (Real-Time PCR)法检测人皮肤成纤维细胞复制性衰老模型中miR-377的表达。5.构建miR-377的过表达病毒载体及抑制慢病毒载体,使用免疫印迹法(Western-Blot)检测转染后细胞DNMT1, Sirtl等蛋白的表达,检测细胞中p-半乳糖苷酶的活性。6.构建DNMT1的3’UTR上miR-377的结合位点序列(野生型)及其突变序列的荧光素酶报告基因重组载体。以探讨miR-377对DNMT1表达的影响。7.收集不同年龄避光部位的皮肤,在体内表皮自然衰老模型、成纤维细胞自然衰老模型中验证miR-377及DNMT1的表达。结果：1.人皮肤成纤维细胞复制性衰老模型中,衰老组与年轻组相比,p-半乳糖苷酶染色率升高(p<0.001)、Sirt1的表达显著下降(p<0.05),说明我们的复制性衰老模型构建成功；DNMT1含量在衰老组的表达明显低于年青组(p<0.05)。2.DNMT1siRNA能显著抑制DNMT1的表达(p<0.05), siRNA处理组与阴性对照组及空白组相比p-半乳糖苷酶染色率明显升高(p <0.01), Sirt1的表达显著下降(p<0.05), DNMT1沉默能使细胞出现衰老表型。3.在人皮肤成纤维细胞复制性衰老模型中,miR-377在衰老组的表达明显高于年轻组(p<0.05)。4.年轻皮肤成纤维细胞中过表达miR-377可使细胞中p-半乳糖苷酶染色率升高(p<0.05), Sirt1表达下降(p<0.05),较空白对照组、阴性对照有统计学意义。在衰老皮肤成纤维细胞中抑制miR-377表达可使p-半乳糖苷酶染色率降低(p<0.05), Sirtl的表达升高(p<0.05),较空白对照组、阴性对照组相比有统计学意义。5、年轻皮肤成纤维细胞中过表达miR-377, miR-377过表达组中DNMT1的表达较空白对照组、阴性对照组明显降低(p<0.05)。而在衰老细胞中抑制miR-377的表达,miR-377抑制组中DNMT1的表达较空白对照组、阴性对照组明显升高(p<0.05)。6.荧光素酶实验结果显示：miR-377与DNMT13’UTR区域存在直接相互作用,miR-377能够调节DNMT1的表达。7.体内实验证明,miR-377在衰老皮肤组织表达明显升高(p<0.05),DNMT1的表达随年龄增加逐步下降(p<0.05)。结论：1.DNMT1在皮肤衰老过程中起重要作用。2.miR-377可以通过直接靶向DNMT13’UTR区,调节DNMT1的表达,从而在皮肤成纤维细胞衰老中起重要作用。