前言 地龙(earthworm)又称蚯蚓，别名“地龙子”，系无脊椎动物，是生物进化过程中最先具有免疫记忆和识别的动物之一，广泛分布于我国各地。具有清热平肝、消炎止痛、活血化淤及主治高热狂燥等功效，可治疗20多种疾病，是我国宝贵的中药材之一。临床上地龙肽常被用于治疗细菌、病毒感染性疾病、免疫性疾病和肿瘤。近年来人们从地龙体内提取了多种具有生物活性的肽类，如纤维蛋白溶解酶、催产素相关肽、肌肉运动活性肽等。地龙肽是地龙体内小分子多肽的总称，种类繁多，生物功能复杂多样。具有免疫活性的地龙肽，因其具有抗肿瘤及增强免疫功能的作用越来越引起人们的关注。例如地龙提取物G-90和912对黑色素瘤和喉癌等肿瘤有明显的抑制作用，912可增加胸腺、脾的重量以及细胞数目，消除放疗引起的T细胞免疫功能的低下和辐射引起的体液免疫功能低下。粗分离的地龙提取物可以活化巨噬细胞，提高NK、LAK细胞的活性，增强ADCC效应。但这些地龙提取物制备简单，成分复杂，分子量大，药效低，副作用大，不利于其药理机制的研究。本试验所用的地龙肽(lumbricus peptide，LP)是经过清洗、破碎、抽提、离心、过滤、超滤及色谱等步骤从新鲜正蚓科(lumbricidea)爱胜属赤子爱胜蚓(Eiscmia foctida)体内提取的小分子量多肽，纯度较高，是由几种8000～20000Dal的多肽组成。本实验室已证实地龙肽在体外实验中可明显增强NK细胞活性，提高NK杀伤率，同IL-2有协同作用，拮抗环磷酰胺和地塞米松的免疫抑制作用。但是尚不清楚此地龙肽对于巨噬细胞等其它免疫细胞以及细胞因子分泌水平的影响，同时小鼠体外实验条件不能代表小鼠整个机体内环境，因此本实验拟建立小鼠地龙肽给药模型和免疫抑制模型，在体外进一步探讨地龙肽对小鼠NK细胞活性的影响，同时还进一步研究地龙肽对巨噬细胞及脾细胞生物活性影响的作用机制，为地龙肽将来能应用于临床提供实验理论依据。 实验材料 1．药品与试剂： 地龙肽：按本试验室方法制备，共有7种多肽成分，分子量为8000—－20000Dal，经E花环形成实验检测具有提高E花环形成能力，用时以蒸馏水配成不同的浓度；环磷酸胺（Cyclophospha－mide，Cy，上海华联制药有公司，200mg／支h 10％FCS RPMI－1640（胎牛血清为华美生物制剂生产八0．5％BSA RPMI－1640（牛血清白蛋白为北京军区兽医防治中心生物工程研究室产＊吩嗓H甲酉硫酸盐即PMS（Bioche而ka）；氧化型辅酶1即NAD（Bio－tee八左旋乳酸（siglna）；碘硝基氯化四氮哩即INTk 入细菌脂多糖（LPS人 GreSS试剂规TI’等。 2．实验动物： C57BL／6纯系小鼠，雌雄各半，体重 20。Zg，6edw，购于本校实验动物部。 s．肿瘤细胞系：小鼠红白细胞白血病细胞（Ya－l）株，小鼠成纤维瘤细胞（p29）株，由本实验室提供，常规方法传代培养。 实验方法 1．实验动物赠及给药： C57BL／6纯系小鼠，雌雄各半，随机分成6组，每组10只，第二组为正常对照组，第2组为低浓度p．lin砂Inl）给药组，第3组为 ·2·中浓度N．5 mg／Inl）给药组，第 4组为高浓度门 mg／nil）给药组，第5组为环磷酸胺组，第 6组为环磷酸胺十地龙肽N．5 mg／Inl）组；23户、6组分别以不同浓度的地龙肽灌胃，每日一次，每次0．ZInl，连续7日，其中5在gg于给药第三天肌注Cy100mg／k，一次，＼5组每日以蒸馏水灌胃0．ZInl。各组均于第8天观察各项指标。 2．NK细胞活性的测定：采用乳酸脱氢酶法。 3．巨噬细胞吞噬功能的测定：采用中性红法。 4．NO测定：采用童氮化反应法。 5．TNF心测定：采用n29细胞作为敏感靶细胞 6．巨噬细胞毒效应测定规rIT比色分析法 7．统计学分析方法：采用t检验，方差分析 实验结果 1．口服地龙肽对小鼠脾细胞中NK细胞杀伤率的影响 地龙肽在浓度为0．lin矿nl刀．sin牙IYl和linyInl时，均可显著提高＊K细胞的活性人P＜O．01L且浓度越大效果越明显；环磷酸胺作为免疫抑制剂可以从多方面抑制机体的免疫功能，其对NK细胞亦有明显的抑制作用；环磷酸胺组与正常组相比。自然杀伤率降低，地龙肽可明显桔抗环磷酸胺的抑制作用汗＜o．05八 2．口服地龙肽对小鼠腹腔＊ 吞噬功能的影响 与正常组相比较，地龙肽在各浓度N．ling／nd刀．5 mg／lld、ling／ml）均能提高巨噬细胞的吞噬功能，但经统计学处理后只有低浓度组效果显著u＜0．01L环磷酸胺十地龙肽组巨噬细胞吞噬功能与环磷酸胺组相比较作用明显增强（P＜O．05X说明地龙肽可明显桔抗环磷酸胺的抑制作用。 3．地龙肽体外对小鼠腹腔肿和脾细胞分泌NO的影响 0．L…giL LP可明显提高巨噬细胞和牌细胞自发及经 LPS ·3·诱生分泌＊o水平u＜o．01人且剂量越大，其作用逐渐减弱；地塞米松作用于巨噬细胞和脾细胞后对．l上上＊