特定分析物的定量测定在生命科学和环境监测领域是非常重要的。其中,光学测试允许在生物环境内进行非侵入性测量,并且可以并行监视多个样本以及进行侵入性较小的生物荧光成像。在目前正在探索的光学传感方法中,基于FRET比率型荧光探针作为一种有潜力提供精确和定量分析的技术而受到了广泛的关注。它的优点是高灵敏度、高选择性并且可以通过两个（或多个）发射信号进行自我校准,提高检测的精准度。细胞内二氧化硫（SO₂）、硫化氢（H₂S）和过氧化氢（H₂O₂）等活性小分子的异常浓度变化可能会产生高血压、心血管和癌症等疾病。因此,设计合成基于FRET机制比率型荧光探针对检测生物活性物种至关重要。本文设计合成了基于ICT-FRET机理检测H₂O₂的比率型荧光探针、基于多信号模式和ICT-FRET机理检测H₂S浓度的比率型荧光探针、基于FRET机理具有优异的信背比的SO₂比率型荧光探针。在第二章中,以香豆素-萘酰亚胺为母体,设计合成了一种基于ICT-FRET机理的H₂O₂比率型荧光探针（CNBE）。为了构建FRET二分体,分别选择发射波长相对较短的香豆素发色团和波长相对较长的萘酰亚胺发色团作为能量供体和受体,通过ICT激活的FRET机制协同作用来调控荧光探针的比率信号。在410 nm的光激发下,探针起初只发出香豆素的荧光。加入H₂O₂后,硼酸频哪醇酯基团转化为具有强给电子能力的羟基。因萘酰亚胺部分的ICT作用使其吸收波长发生明显红移,进而激活了探针的FRET过程,显示出萘酰亚胺的荧光。探针对H₂O₂表现出良好的选择性和灵敏度并成功应用于活细胞和斑马鱼的比率荧光成像检测。在第三章中,设计合成了基于协同作用的ICT-FRET双调控机制的比率型荧光探针（NapN₃-PCM）,该探针包含两个不同灵敏度的H₂S识别位点:叠氮基萘酰亚胺衍生物和花色素发射团,能够通过两个不同发射带的双重荧光信号模式简洁地确定H₂S浓度水平。当与低浓度的H₂S响应后,NapN₃-PCM在535 nm和650 nm发射带之间表现出协同变化,并且比率信号(I₅₃₅/I₆₅₀)的波动较小。但是当遇到高浓度的H₂S时,NapN₃-PCM在相同的两个发射带之间产生拮抗变化,并且比率信号显著增强。NapN₃-PCM表现出良好的生物相容性并成功应用比例荧光成像技术检测活细胞和斑马鱼中的H₂S浓度水平。在第四章中,提出了一种设计比率型荧光探针的新策略,该探针由刚性荧光团-分子转子二分体组成,并在粘性系统中具有优异的响应信背比。为了验证这种新的设计策略,制备了一种基于香豆素-半花菁二分体的实用型二氧化硫（SO₂）荧光探针（RFC-MRC）。探针与SO₂发生亲核加成反应,使探针的发射波长发生蓝移。与在非粘性环境中SO₂引起的比例响应信号（35.4倍增强）相比,在粘性系统中会显示出更优异的荧光响应信号（71.5倍增强）。该探针可以选择性地富集在线粒体中,并通过共聚焦荧光成像成功地用于检测活HeLa细胞中的SO₂。此外,在使用探针RFC-MRC监测凋亡细胞中SO₂的荧光成像实验中,观察到早期的凋亡细胞（51.2倍增强）比晚期的凋亡细胞（37.1倍增强）拥有更优异的的信背比。