论文部分内容阅读
甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂(SFs)是一类重要的农用杀菌剂，也是最畅销的杀菌剂。SFs是一种线粒体呼吸抑制剂，通过在细胞色素b和c1间转移电子，来抑制靶真菌的线粒体呼吸以抑制三磷酸腺苷(ATP)的合成并引起氧化应激损伤。已有研究表明，SFs在包括土壤样品在内的多种环境样品中均有不同浓度的检出。因此，研究该类杀菌剂对非靶标生物的毒性效应及其机制显得尤为重要。氟嘧菌酯(FLUO)是SFs中一种典型代表，被广泛用于茎叶处理，可有效地防治蔬菜、马铃薯等的真菌病害。随着FLUO的使用，导致其在土壤环境中积累(降解半衰期为16~119d)，并一定程度上影响土壤生态系统。
蚯蚓是陆地生态系统中至关重要的一环，可用于评估污染物对土壤生物的风险。经济合作与发展组织(OECD)将赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)确定为土壤模式动物。近年来，SFs对不同环境中的非靶标生物的毒性研究已引起广泛关注。其中，FLUO是一种新兴SFs，相关研究相对较少，对Eiseniafetida的毒性效应研究更是近乎空白，仅有其在人工土中的研究。
采用人工土来进行毒理试验可较好的控制土壤条件，保证毒理结果不受土壤条件的影响，以便可以比较不同污染物之间的毒性效应。然而现实条件下，污染物通过各种途径进入不同类型土壤，不同土壤的理化性质会影响污染物的毒性效应。这引发一个思考，即，FLUO在人工土中对Eiseniafetida的毒性效应是否可以准确的表征其在真实土壤环境中可能引起的毒性效应？
因此，本研究选择了实际田间土壤(潮土，红壤和黑土)，以活性氧簇(ROS)、超氧化物歧化酶活性(SOD)、过氧化氢酶活性(CAT)、谷胱甘肽硫转移酶活性(GST)、丙二醛(MDA)和8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)含量为终点，来评估在对照组(NF)和0.1mgkg-1(LF)、1.0mgkg-1(MF)、2.5mgkg-1(HF)FLUO暴露28天后对Eiseniafetida的毒性效应及其效应机制。为了更加明确地比较FLUO在不同土壤类型中对Eiseniafetida的毒性差异，我们选择HF处理组暴露28天后的ROS含量，MDA含量和3种酶活性，来计算综合生物标记物响应指数(Integrated biomarker response，IBR v2)。同时采用转录组学(二代测序技术RNA-seq，Illumina，pair-end)及蛋白组学(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation，iTRAQ技术)，研究蚯蚓在潮土中暴露于FLUO后，自身基因表达及蛋白表达的差异变化，以探明FLUO在土壤中对Eiseniafetida的毒性作用机制。可得到以下结果及结论：
1)氟嘧菌酯在不同类型土壤中均能诱导Eiseniafetida产生氧化胁迫和DNA损伤：在不同土壤中，FLUO均可诱导Eiseniafetida体内ROS含量增加，且随暴露浓度的增加而逐渐升高，具有一定剂量–效应关系，对蚯蚓体内的抗氧化酶系(SOD和CAT)活性也具有影响。FLUO暴露还会引起蚯蚓体内产生脂质过氧化及DNA损伤，具体表现为MDA含量及8-OHdG含量上升。
2)采用IBR指数，得出FLUO在不同类型土壤中对Eiseniafetida毒性表现存在差异：红壤＞潮土＞黑土＞人工土；因此，我们认为在人工土中FLUO的毒理学测试结果低估了其在真实环境中的毒性。此外，FLUO在不同土壤中都能对土壤动物Eiseniafetida产生不同程度的毒性效应。
3)比较了FLUO处理前后Eiseniafetida在转录组水平的差异表达，同时，也分析了差异表达基因(DEGs)及其功能和代谢通路途径：
(a)经不同浓度的FLUO处理后，Eiseniafetida体内细胞中的基因在转录水平表达发生改变：在NF与LF中有225个DEGs，相对于NF上调表达的基因有128个，下调表达基因有97个；在NF与MF中有352个DEGs，相对于NF上调表达的基因有224个，下调表达基因有128个；而在NF与HF中有296个DEGs，相对于NF上调表达的基因有160个，下调表达基因有136个；
(b)共筛选到27个在不同浓度FLUO处理条件下均发生显著变化的基因，这些基因参与了蛋白质的折叠、分类和降解，信号转导，免疫以及细胞生长等相关的生物学途径，FLUO作为一种杀菌剂，对Eiseniafetida的正常基础生理活动造成了一定的胁迫；
(c)Eiseniafetida对不同浓度FLUO存在胁迫响应：低浓度FLUO主要影响胞外区域相关的基因功能和激酶的活性；中浓度FLUO则诱导Eiseniafetida细胞内众多不同功能的基因编码蛋白产生应激响应，多种基础物质代谢的通路发生显著变化；而在高浓度FLUO条件下，Eiseniafetida体内多数基因功能和通路受到显著抑制，免疫相关功能基因和途径开始发挥作用。整体而言，各处理组Eiseniafetida细胞均出现凋亡，且凋亡程度随着FLUO浓度升高而加剧。
4)比较了FLUO处理前后Eiseniafetida在蛋白组水平的差异表达，并对差异表达蛋白(DEPs)及其功能和代谢通路途径进行了分析：
(a)经不同浓度的FLUO处理后，Eiseniafetida体内细胞中的蛋白质表达水平发生改变：在NF与LF中DEPs有261个，相对于NF，上调蛋白为74个，下调蛋白为187个；在NF与MF中，共383个DEPs，相对于NF，上调蛋白为137个，下调蛋白为246个；在NF与HF中，共330个DEPs，相对于NF，上调蛋白为108个，下调蛋白为222个；
(b)共筛选到59个在不同浓度FLUO处理条件下均发生显著变化的蛋白，这些蛋白具有与细胞凋亡等相关的功能，参与了信号分子与相互作用、细胞生长与死亡、信号转导、免疫系统等相关的生物学途径。FLUO可影响激酶活性，抑制ATP合成以引起Eiseniafetida产生氧化应激，诱导各处理组Eiseniafetida细胞均出现凋亡，且凋亡程度随着FLUO浓度升高而加剧。
(c)在NF-vs-LF，NF-vs-MF和NF-vs-HF三个处理组中没有显著富集到的共有通路。Eiseniafetida对不同浓度FLUO存在胁迫响应：低浓度FLUO没有对结构分子活性造成显著影响；中浓度FLUO条件下，引起Eiseniafetida体内产生氧化应激，免疫相关功能蛋白和途径开始发挥作用；而在高浓度FLUO条件下，Eiseniafetida体内多数蛋白功能和通路受到显著抑制，可诱导机体产生免疫相关功能。
本研究系统研究了FLUO在不同土壤中对Eiseniafetida的毒性效应，并比较了其在不同土壤中的毒性差异。同时，通过对Eiseniafetida转录组学及蛋白组学研究探明了FLUO对Eiseniafetida的毒性作用机制。明确了更多关于该类杀菌剂的毒理学数据，为评价FLUO等SFs对蚯蚓的毒性机制提供科学依据。
蚯蚓是陆地生态系统中至关重要的一环，可用于评估污染物对土壤生物的风险。经济合作与发展组织(OECD)将赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)确定为土壤模式动物。近年来，SFs对不同环境中的非靶标生物的毒性研究已引起广泛关注。其中，FLUO是一种新兴SFs，相关研究相对较少，对Eiseniafetida的毒性效应研究更是近乎空白，仅有其在人工土中的研究。
采用人工土来进行毒理试验可较好的控制土壤条件，保证毒理结果不受土壤条件的影响，以便可以比较不同污染物之间的毒性效应。然而现实条件下，污染物通过各种途径进入不同类型土壤，不同土壤的理化性质会影响污染物的毒性效应。这引发一个思考，即，FLUO在人工土中对Eiseniafetida的毒性效应是否可以准确的表征其在真实土壤环境中可能引起的毒性效应？
因此，本研究选择了实际田间土壤(潮土，红壤和黑土)，以活性氧簇(ROS)、超氧化物歧化酶活性(SOD)、过氧化氢酶活性(CAT)、谷胱甘肽硫转移酶活性(GST)、丙二醛(MDA)和8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)含量为终点，来评估在对照组(NF)和0.1mgkg-1(LF)、1.0mgkg-1(MF)、2.5mgkg-1(HF)FLUO暴露28天后对Eiseniafetida的毒性效应及其效应机制。为了更加明确地比较FLUO在不同土壤类型中对Eiseniafetida的毒性差异，我们选择HF处理组暴露28天后的ROS含量，MDA含量和3种酶活性，来计算综合生物标记物响应指数(Integrated biomarker response，IBR v2)。同时采用转录组学(二代测序技术RNA-seq，Illumina，pair-end)及蛋白组学(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation，iTRAQ技术)，研究蚯蚓在潮土中暴露于FLUO后，自身基因表达及蛋白表达的差异变化，以探明FLUO在土壤中对Eiseniafetida的毒性作用机制。可得到以下结果及结论：
1)氟嘧菌酯在不同类型土壤中均能诱导Eiseniafetida产生氧化胁迫和DNA损伤：在不同土壤中，FLUO均可诱导Eiseniafetida体内ROS含量增加，且随暴露浓度的增加而逐渐升高，具有一定剂量–效应关系，对蚯蚓体内的抗氧化酶系(SOD和CAT)活性也具有影响。FLUO暴露还会引起蚯蚓体内产生脂质过氧化及DNA损伤，具体表现为MDA含量及8-OHdG含量上升。
2)采用IBR指数，得出FLUO在不同类型土壤中对Eiseniafetida毒性表现存在差异：红壤＞潮土＞黑土＞人工土；因此，我们认为在人工土中FLUO的毒理学测试结果低估了其在真实环境中的毒性。此外，FLUO在不同土壤中都能对土壤动物Eiseniafetida产生不同程度的毒性效应。
3)比较了FLUO处理前后Eiseniafetida在转录组水平的差异表达，同时，也分析了差异表达基因(DEGs)及其功能和代谢通路途径：
(a)经不同浓度的FLUO处理后，Eiseniafetida体内细胞中的基因在转录水平表达发生改变：在NF与LF中有225个DEGs，相对于NF上调表达的基因有128个，下调表达基因有97个；在NF与MF中有352个DEGs，相对于NF上调表达的基因有224个，下调表达基因有128个；而在NF与HF中有296个DEGs，相对于NF上调表达的基因有160个，下调表达基因有136个；
(b)共筛选到27个在不同浓度FLUO处理条件下均发生显著变化的基因，这些基因参与了蛋白质的折叠、分类和降解，信号转导，免疫以及细胞生长等相关的生物学途径，FLUO作为一种杀菌剂，对Eiseniafetida的正常基础生理活动造成了一定的胁迫；
(c)Eiseniafetida对不同浓度FLUO存在胁迫响应：低浓度FLUO主要影响胞外区域相关的基因功能和激酶的活性；中浓度FLUO则诱导Eiseniafetida细胞内众多不同功能的基因编码蛋白产生应激响应，多种基础物质代谢的通路发生显著变化；而在高浓度FLUO条件下，Eiseniafetida体内多数基因功能和通路受到显著抑制，免疫相关功能基因和途径开始发挥作用。整体而言，各处理组Eiseniafetida细胞均出现凋亡，且凋亡程度随着FLUO浓度升高而加剧。
4)比较了FLUO处理前后Eiseniafetida在蛋白组水平的差异表达，并对差异表达蛋白(DEPs)及其功能和代谢通路途径进行了分析：
(a)经不同浓度的FLUO处理后，Eiseniafetida体内细胞中的蛋白质表达水平发生改变：在NF与LF中DEPs有261个，相对于NF，上调蛋白为74个，下调蛋白为187个；在NF与MF中，共383个DEPs，相对于NF，上调蛋白为137个，下调蛋白为246个；在NF与HF中，共330个DEPs，相对于NF，上调蛋白为108个，下调蛋白为222个；
(b)共筛选到59个在不同浓度FLUO处理条件下均发生显著变化的蛋白，这些蛋白具有与细胞凋亡等相关的功能，参与了信号分子与相互作用、细胞生长与死亡、信号转导、免疫系统等相关的生物学途径。FLUO可影响激酶活性，抑制ATP合成以引起Eiseniafetida产生氧化应激，诱导各处理组Eiseniafetida细胞均出现凋亡，且凋亡程度随着FLUO浓度升高而加剧。
(c)在NF-vs-LF，NF-vs-MF和NF-vs-HF三个处理组中没有显著富集到的共有通路。Eiseniafetida对不同浓度FLUO存在胁迫响应：低浓度FLUO没有对结构分子活性造成显著影响；中浓度FLUO条件下，引起Eiseniafetida体内产生氧化应激，免疫相关功能蛋白和途径开始发挥作用；而在高浓度FLUO条件下，Eiseniafetida体内多数蛋白功能和通路受到显著抑制，可诱导机体产生免疫相关功能。
本研究系统研究了FLUO在不同土壤中对Eiseniafetida的毒性效应，并比较了其在不同土壤中的毒性差异。同时，通过对Eiseniafetida转录组学及蛋白组学研究探明了FLUO对Eiseniafetida的毒性作用机制。明确了更多关于该类杀菌剂的毒理学数据，为评价FLUO等SFs对蚯蚓的毒性机制提供科学依据。