老鸦瓣Tulipa edulis(Miq.)Baker为百合科(Liliaceae)郁金香属(Tulipa)植物,其干燥鳞茎为中药光慈姑。光慈姑味甘,性寒,有毒,具有行血化瘀、解毒散结的功效,主治瘰疬,疮肿,痈疽,咽喉肿痛,产后瘀滞。根据植物志记载及实际调查结果,其主要分布于安徽、江苏、浙江、江西、湖北、山东、河南、陕西、辽宁等地。随着药用价值的开发,光慈姑在临床上的应用也越来越广泛,市场对光慈姑的需求也逐年增加。但老鸦瓣自然更新速度非常缓慢,其野生资源日趋匮乏。因此,开展老鸦瓣人工栽培技术研究十分迫切,而开展老鸦瓣种质资源遗传多样性评价研究,是有效保护、合理利用老鸦瓣的基础。目前国内外对老鸦瓣种质资源研究还是空白,缺乏不同居群间表型性状、遗传变异及药用成分的比较与分析。此外,中药的品质由遗传特性及生长环境所决定,其中遗传因素是决定中药材品质的内因。因此开展老鸦瓣资源调查及其遗传多样性研究意义重大。本研究通过资源调查,采用形态学、孢粉学、分子遗传标记及植物化学等技术,以中国10个省份28个老鸦瓣居群为材料,从表型、DNA及代谢产物三个层面,对中国老鸦瓣种质资源遗传多样性进行研究,探讨老鸦瓣遗传多样性特性及其与药材品质的关系,为有效保护、合理开发利用老鸦瓣种质资源提供理论依据。本研究的主要内容及结果如下:(1)通过对10个省份30个样点进行实地种质资源调查,结果显示老鸦瓣按照水系流域分布,其主要分布在长江中下游、黄河中下游流域、淮河流域及环渤海地区,其中集中分布在长江中下游及淮河流域,如江苏中北部、安徽中北部;主成分分析结果表明,影响老鸦瓣分布的地理及气候因子主要为年活动积温、年降水量及年日照时数,但老鸦瓣分布生境类型丰富,其对温度、光照、湿度及土壤类型的适应性较广;生境类型对老鸦瓣的繁殖方式有一定的影响。(2)对不同居群老鸦瓣的10个表型性状进行了分析,结果表明,不同居群老鸦瓣在叶及鳞茎等形态性状上存在显著差异,具有丰富的遗传变异。主成分分析结果表明鳞茎直径、鳞茎鲜重为老鸦瓣形态变异的主要因素。(3)应用扫描电镜技术对不同居群老鸦瓣花粉进行形态观察与比较分析。结果显示,老鸦瓣花粉为椭球形至长椭球形,赤道面观均为舟形。萌发沟均为单沟,均不具盖,萌发沟延伸至两极,沟中部比两端狭窄。不同居群老鸦瓣在花粉大小、表面纹饰等方面存在差异。表面纹饰的差异主要体现在纹饰类型、网脊宽度、网眼形状、大小及密度等方面。根据表面纹饰特征差异,将老鸦瓣花粉分为Ⅰ类条纹花粉及Ⅱ类网纹花粉,Ⅱ类网纹状花粉再根据网脊的宽度又分为Ⅱ a与Ⅱ b两类。Ⅱa的网脊<0.40μm,由单个或2至5个长短、方向不一的短线脊组成,网眼较大;Ⅱb的网脊>0.40 μm,其主要特征是由2至多个长短、方向不一的短线脊组成,网脊较宽,网眼较小。(4)利用ISSR(Inter-Simple Sequence Repeats)分子标记技术分析老鸦瓣遗传多样性。结果表明,在物种水平上,多态性位点百分率(PPL)为94.80%,Nei’s多样性指数(He)为0.2648。居群水平上,PPL变化范围为12.80%～40.40%,平均为28.23%。Nei’s基因分化系数(Gst)为0.533,表明居群间的遗传变异较大,居群内也存在一定的分化。UPGMA法及PCoA法的分析结果表明,不同居群老鸦瓣基本按照地理远近关系而分为五大类群,经Mantel分析,不同居群老鸦瓣遗传距离与地理距离存在一定的相关性,但个别居群也不完全按照地理距离划分。(5)应用 SRAP(Sequence-Related Amplified Polymorlphism)标记对不同老鸦瓣种质资源进行了遗传多样性水平和遗传结构分析。结果表明:在物种水平上,多态性位点百分率(PPL)高达100.00%,Nei’s多样性指数(He)为0.3311,Shannon信息指数(Ⅰ)为0.4873。居群水平上,PPL在28.48%～57.44%,平均为43.62%,PPL值较高的有河南新乡辉县及河南息县等居群。河南新乡辉县、辽宁大连、河南息县等居群的He及Ⅰ值均高于其他居群,具有较丰富的遗传多样性。He及Ⅰ与PPL值的大小变化趋势基本一致。Nei’s基因分化系数(Gst)为0.5024,表明居群内与居群间的遗传变异相当;采用UPGMA及PCoA法对28份老鸦瓣种质进行亲缘关系分析,其结果与ISSR分析略有差异,但基本呈现一致性。(6)对不同居群老鸦瓣核糖体ITS2序列进行了比较分析。结果显示ITS2序列有效分析长度为474 bp,G + C的平均含量为60.1%。ITS2序列共有18个变异位点,其中14个单核苷酸变异位点,4个简约信息变异位点。单倍型多样度(Hd)为0.561,核苷酸多态性(Pi)为0.0042,平均核苷酸差异数(K)为1.974,显示ITS2序列存在一定的遗传变异。根据ITS2序列遗传距离,应用UPGMA及PCoA法进行亲缘关系分析,结果表明,老鸦瓣种内至少存在三个变异类型,其中河南桐柏山居群构成一单系分支,其他两大变异类群基本按照地缘关系分成南北两大类型。(7)对不同居群老鸦瓣叶绿体matK序列进行了比较分析。结果显示matK序列有效分析长度为886 bp,G + C的平均含量为31.6%;matK序列共有36个变异位点,其中22个单核苷酸变异为点,14个简约信息变异为点;Hd为0.997,Pi为0.00651,K为5.766,与ITS2序列遗传变异参数相比较,matK序列提供了更丰富的遗传变异信息;根据matK序列的遗传距离,应用UPGMA及PCoA法进行遗传关系分析,其结果与ITS2序列分析结果基本一致;matK与ITS2序列相结合进行分析其优势明显。(8)采用marK、rbcL及psbA-trnH三个DNA序列作为DNA条形码技术,研究其在老鸦瓣物种鉴定中的作用。研究结果显示,老鸦瓣及同属植物的rbcL及psbA-trnH序列较为保守,序列变异位点很少,只能将老鸦瓣及同属植物与百合科其他属植物鉴别出来,而不足以在属内将老鸦瓣鉴别出来;而老鸦瓣及同属植物的matK序列遗传变异丰富,不仅可以将老鸦瓣及同属植物与百合科其他属植物鉴别出来,而且在属内水平也可以将老鸦瓣与同属植物鉴别出来,因此,matK序列可以作为老鸦瓣物种鉴定及其药材光慈姑真伪鉴定的DNA条形码。(9)建立了光慈姑多糖含量的提取及测定方法,对不同产地光慈姑药材进行了质量评价。结果表明,不同产地光慈姑药材多糖含量在8.1593～206.0053mg·g-1之间,不同产地光慈姑多糖含量差异显著,山东泰山光慈姑多糖含量最高,浙江湖州莫干山含量最低。光慈姑多糖含量高低与纬度、温度及光照等地理气候因子相关,从南至北,光慈姑多糖含量呈增加的趋势。同时应用近红外光谱结合偏最小二乘回归法,建立了快速测定光慈姑多糖的定量分析模型,模型的内部交叉验证均方差(RMESCV)值为0.0031,决定系数R2达到了 0.9994,结果显示模型的分析效果非常理想,可以用于大批量光慈姑多糖的快速测定。(10)运用等离子体发射光谱法测定了光慈姑药材中26种无机元素含量。结果表明,在大量元素中,K、Ca、Mg的含量比较高,在微量元素中Mn的含量最高,不同产地光慈姑各元素含量差异显著。主成分分析表明K、Ca及Mg元素是导致样品差异的主导因子。各产地光慈姑药材中Pb、As、Cu及Cr等重金属的含量都较低,符合《中国药典》相关规定。应用近红外光谱结合偏最小二乘回归法,建立了快速同时测定光慈姑无机元素的定量分析模型,结果表明,该定量模型对光慈姑无机元素含量具有一定的分析能力,但对不同元素的分析效果不一样,对Pb、Ni、Sn及Fe元素含量分析效果较好,而对其他元素含量分析结果误差较大,因此,应继续收集更多样品进一步优化模型。