子痫前期(pre-eclampsia)和子痫(eclampsia)是妊娠期特有的疾病,发生在妊娠20周以后,表现为以高血压、蛋白尿、水肿为主要特征的多器官功能损害的综合征,严重威胁母婴安全和健康,是产科死亡的重要原因之一,但其病因和发病机制至今尚不完全清楚,目前普遍认为特发性小动脉痉挛、血管内皮损伤是子痫和子痫前期发病机理的中心环节和基本特征。血管内皮细胞有重要的内分泌功能,通过自分泌释放血管活性因子,如一氧化氮、内皮素、前列腺素等调节血管舒缩,协调凝血与抗凝血间的平衡,参与组织与血液间物质的交换。当血管内皮细胞受细胞毒性物质和炎性介质,如肿瘤坏死因子α(tumornecrosis factor alpha,TNF-α)作用时,可引起血管内皮损伤,导致血管收缩因子和舒张因子比例失调,出现子痫前期和子痫一系列病理变化。Faas等最早发现低剂量内毒素(1.0μg/kg)可使孕鼠血压逐渐升高,并能维持较高的血压水平,产后血压有下降趋势,利用内毒素可以制备较理想的子痫前期动物模型。有实验报道内毒素可以促使单核细胞、巨噬细胞释放TNF-α,TNF-α可以刺激血管收缩的物质内皮素的释放。近年来,越来越多的研究也表明内毒素(endotoxin,ET)刺激天然免疫系统所产生的过度炎症反应在子痫前期的发生、发展和转归过程中具有重要作用。鉴于这些研究报道,我们在实验中选择应用低剂量的内毒素注射建立子痫前期的大鼠模型。由于子痫前期和子痫的病因和发病机制没有定论,所以在在子痫前期和子痫的预防及治疗方面虽然取得了一些进展,例如硫酸镁的合理应用避免了中毒等副作用的发生及抗凝剂蛋白S、蛋白C的应用阻止了弥漫性血管内凝血(dessiminated intiavascular coagulation,DIC)的发生等,但是所有这些方法都是化学药物治疗,有其副作用,而且至今没有提出新的有效的治疗方法。近年来随着对低能量激光生物作用的深入研究,发现低能量激光照射有降血粘度、降血脂、提高红细胞携氧能力,改善微循环,并具有活化酶,提高免疫功能和抗氧化功能等作用,因此在临床已用于脑梗死、高血压、高血脂、冠心病、糖尿病、肺部疾患、偏头痛、肝炎、类风湿关节炎、过敏性鼻炎等200多种疾病的治疗,并且取得了可靠的疗效。鉴于低能量激光的以上治疗作用,我们考虑子痫前期也有血压升高及血液流变方面的改变,不知将低能量激光应用于子痫前期的治疗是否同样有效,目前国内外尚没有文献报道,这是本实验研究的目的所在。【目的】1、为了更好地研究子痫前期的病因和发病机制及新的预防和治疗方法,需要稳定的动物模型。从Faas等研究报道内毒素可以建立子痫前期大鼠模型以来,越来越多的研究倾向于应用内毒素建立子痫前期动物模型。我们查阅文献比较了各种方法的优缺点以后,选择应用低剂量的内毒素建立子痫前期大鼠模型,为下一步的治疗研究奠定基础。2、鉴于低能量激光改善微循环、提高免疫功能和抗氧化能力等作用,在模型建立成功的基础上,观察低能量激光照射对子痫前期大鼠模型的治疗作用及器官组织的病理改变。【方法】1、实验动物建立模型时40只雌性成年SD大鼠,体重200-250克,20只雄性成年SD大鼠,体重250-300克。随机选择20只雌性大鼠分别与20只雄性大鼠1:1共笼,次日清晨观察阴栓若未见阴栓取阴道分泌物检查,发现阴栓或精子为妊娠第0天,剩余20只雌性大鼠不作受孕处理为对照组。激光照射时选用SD孕鼠40只,受孕及饲养条件与建模时一样。2、动物分组及建立模型将40只大鼠分为四组,分别为:非孕注射生理盐水组(nonpregnancy salinegroup,NS)、受孕注射生理盐水组pregnancy saline group,PS)、非孕注射内毒素组(nonpregnancy endotoxin group,NE)和受孕注射内毒素组(pregnancyendotoxin group,PE),每组10只。PS组及PE组在妊娠14d沿鼠尾静脉分别注射生理盐水及内毒素(按1.0μg/kg注射,浓度0.1μg/ml),NS组及NE组在同一天做对应处理。3、子痫前期大鼠模型的标准查阅目前的文献报道,通常选用血压、尿蛋白及仔鼠和胎盘情况来确定模型是否成功,但是各指标的具体数值还没有公认的统一标准,因为选择实验的动物种类及测量仪器的不同,指标的基础值也有很大的差异,均是通过设置对照组从而比较组间上述指标差异有统计学意义来定义子痫前期模型。4、低能量激光照射治疗我们在模型成功的基础上进一步运用激光照射并观察其疗效。40只孕鼠平均分为四组:生理盐水组、生理盐水照射组、内毒素组和实验组,内毒素组和实验组妊娠14天与建模部分一样注射内毒素,生理盐水组和生理盐水照射组注射生理盐水,且实验组和生理盐水照射组妊娠16天开始激光照射,每天一次,一次30min,直到妊娠19天。5、监测指标妊娠第13、15、17、19天测量鼠尾动脉收缩压(systolic blood pressure,SBP),妊娠第11、15、19天收集24h尿液测量蛋白含量,妊娠第7、20天尾静脉抽血测血清中谷丙转氨酶(ALT)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)及TNF-α值,妊娠第20天处死大鼠取肝、肾、肺、心、脑及孕鼠胎盘组织做病理切片,同时计数仔鼠数量和体重及胎盘湿重。6、统计学处理所有数据均应用SPSS13.0统计软件分析,计量资料用均数±标准差((?)±S)表示,每组不同时间点比较采用重复测量方差分析(ANOVA for repeatedmeasurement),分组因素的单独效应分析采用完全随机设计资料的方差分析(One-way for ANOVA),多重比较满足方差齐性检验时采用Bonferroni法,不满足方差齐性检验时采用Dunnett’sT3法,仔鼠数量用非参数检验,以P≦0.05(双侧)表示统计学上有显著性差异。【结果】1大鼠注射内毒素建立子痫前期动物模型的结果1.1尾动脉收缩压:妊娠第13天四组大鼠基础SBP差异无显著性(P=0.179),四组动物有可比性;第15天PE组SBP升高,PE与NS、PS、NE比较,差异均有显著性(P＜0.05);第17天PE组SBP继续升高,PE与NS、PS、NE比较,均有显著性差异(P＜0.05);第19天PE组SBP继续升高,PE与NS、PS、NE比较,均有显著性差异(P＜0.05);且从妊娠15天开始PE组SBP逐渐升高,与子痫前期表现一致。1.2尿蛋白:妊娠第11天四组尿蛋白含量差异无显著性(P=0.759);妊娠第15天PE组24h尿蛋白升高,四组总体尿蛋白有显著性差异(P=0.048),由于方差不齐,我们进行两两比较,发现组间差异无显著性(P＞0.05),同时我们也试用了近似方差齐性检验,同样没有发现显著性差异,分析因为P=0.048接近于0.05,这种情况下会出现摆动,所以造成了两两比较无差异:妊娠第19天PE24小时尿蛋白含量升高,四组整天差异有显著性(P=0.011),PE与NS、PS、NE比较,差异均有显著性(P＜0.05)。PE组3次测量结果整体差异显著(P=0.003),且逐渐升高,而其余三组三次测量结果组内均无显著性差异(P＞0.05),与子痫前期表现一致。1.3血清ALT:第7天四组大鼠间ALT无显著差异(P=0.578),妊娠第20天PE组升高,四组相比差异有显著性(P=0.002),PE与NS、PS、NE比较,差异均有显著性(P＜0.05)。1.4血清BUN:第7天四组大鼠间BUN无差异(P=0.097),妊娠第20天PE组BUN升高,四组整体比较差异有显著性(P=0.002),其中两两比较PE与NS、PS、NE比较,差异有显著性(P＜0.05),其余三组两两比较测量值差异无显著性(P＞0.05)。1.5血清Cr:第7天四组大鼠间Cr无差异(P=0.824),妊娠第20天PE组Cr升高,四组整体比较差异有显著性(P=0.000),其中两两比较PE与NS、PS、NE比较,差异均有显著性(P＜0.05);PE组内两次测量值有显著性差异(P=0.002),其余三组测量值组内均无显著性差异(P＞0.05)。1.6血清TNF-α:妊娠第7天PS和PE两组大鼠间无显著性差异(P=0.938);妊娠第20天PE组有升高,与PS相比差异有统计学意义(P=0.000),且PE组内差异有显著性(P=0.000),PS组内无显著性差异(P=0.604)。1.7仔鼠数量、体重及胎盘湿重:两组间仔鼠数量无显著性差异(P=0.936),PE组仔鼠重量显著低于PS组,差异有统计学意义(P=0.000),PE组胎盘湿重显著低于PS组,差异有统计学意义(P=0.011)。1.8各组孕鼠肾脏组织学观察:NS、PS和NE大鼠肾脏结构正常,可见完整的肾单位,其中肾小球及肾小管形态正常;PE大鼠肾小管上皮细胞变性、坏死,细胞脱落,肾小管管腔变窄,肾间质水肿。1.9各组孕鼠肝脏组织学观察:NS、PS和NE大鼠肝小叶排列整齐,汇管区无充血,肝窦无扩张,肝细胞形态正常,无充血坏死,无炎细胞浸润;PE大鼠肝组织有点片状坏死,结构不清,肝细胞破裂,细胞核溶解。1.10各组孕鼠胎盘组织学观察:PS大鼠胎盘蜕膜带薄,主要由纤维性成分组成。基带为数层滋养叶巨细胞及少量糖原细胞组成的网络样结构,母血从中通过进入迷路带。迷路带为终末绒毛吻合成网,形成迷路样结构,网眼为母血间隙,是母血与胎儿血进行物质交换的地方。PE大鼠蜕膜带肿胀增厚,炎性细胞浸润;基带滋养叶巨细胞增生,空泡化细胞岛增多,基带增厚;迷路带滋养叶细胞增生肥大,部分水肿,血间膜增厚。1.11各组孕鼠心肌组织学观察:NS、PS和NE大鼠心肌细胞排列规则,结构正常,肌细胞间有小血管,PE大鼠心肌间质有明显水肿,肌细胞间血管减少,但心肌细胞未见水肿、坏死等改变。2.12各组孕鼠脑组织学观察:四组孕鼠脑组织观察没有什么差别,未见明显水肿、充血、出血、坏死等病理改变。2低能量激光照射大鼠子痫前期模型前后的结果2.1尾动脉收缩压:四组间第13天基础SBP波动在90-93mmHg之间,无显著性差异(P=0.479),说明四组动物具有可比性;第15天四组间整体有显著性差异(P=0.000),其中实验组SBP与生理盐水组和生理盐水照射组相比,差异有显著性(P＜0.05),实验组与内毒素组SBP相比,无显著性差异(P=0.341);第17天四组整体间有显著性差异(P=0.000),其中实验组SBP与生理盐水组和生理盐水照射组相比,差异有显著性(P＜0.05),实验组与内毒素组SBP相比,有显著性差异(P=0.009);第19天四组间有显著性(P=0.000),其中实验组SBP与生理盐水组和生理盐水照射组相比,差异无显著性(P＞0.05),实验组与内毒素组SBP相比,有显著性差异(P=0.000)。2.2尿蛋白:妊娠第13天四组尿蛋白含量无明显差异(P=0.648),四组动物具有可比性;妊娠第15天四组整体差异有显著性(P=0.001),其中实验组与生理盐水组和盐水照射组尿蛋白相比差异有显著性(P＜0.05),与内毒素组相比无显著性差异(P=0.507);妊娠第19天四组整体差异有显著性(P=0.000),其中内毒素组尿蛋白升高,与实验组相比有显著差别,差异有统计学意义(P=0.003),实验组与生理盐水组和盐水照射组间尿蛋白含量无显著差别(P＞0.05)。2.3血清ALT:妊娠第7天四组大鼠间基础血清ALT无显著性差异(P=1.000),说明四组动物具有可比性;妊娠第20天四组整体差异有显著性(P=0.000),其中实验组ALT与内毒素组相比,差异有显著性(P=0.000),实验组与生理盐水组和盐水照射组比较,差异无显著性(P=1.000)。2.4血清BUN:妊娠第7天四组大鼠间基础血清BUN无显著性差异(P=0.905),说明四组动物具有可比性;妊娠第20天四组间整体差异有显著性(P=0.000),其中实验组BUN与内毒素组相比,差异有显著性(P=0.000),实验组与生理盐水组和盐水照射组比较,差异无显著性(P=1.000)。2.5血清Cr:妊娠第7天四组大鼠间基础血清Cr无显著性差异(P=0.957),说明四组动物具有可比性;妊娠第20天四组整体差异有显著性(P=0.049),其中实验组Cr与内毒素组相比,差异有显著性(P=0.040),实验组与生理盐水组和盐水照射组比较,差异无显著性(P=1.000)。2.6各组血清TNF-α:妊娠第7天四组大鼠间血清TNF-α无显著性差异(P=0.988),四组动物具有可比性;妊娠第20天四组整体差异有显著性(P=0.000),其中内毒素组有升高,与激光治疗组相比差异有统计学意义(P=0.000),实验组与生理盐水组和盐水照射组比较,差异无显著性(P=1.000)。2.7仔鼠数量、重量及胎盘湿重:四组间仔鼠数量无显著性差异(P=0.996);实验组仔鼠重量和胎盘湿重与生理盐水组和盐水照射组无显著性差异(P=1.000),实验组与内毒素组仔鼠重量有显著性差异(P=0.000),实验组和内毒素胎盘湿重有显著性差异(P=0.021)。2.8各组孕鼠肾脏组织学观察:生理盐水组和生理盐水照射组肾脏结构正常,可见完整的肾单位,其中肾小球及肾小管形态正常;内毒素组肾小管上皮细胞变性、坏死,细胞脱落,肾小管管腔变窄,肾间质水肿,实验组经过激光照射以上病变减轻。2.9各组孕鼠肝脏组织学观察:生理盐水组和生理盐水照射组肝小叶排列整齐,汇管区无充血,肝窦无扩张,肝细胞形态正常,无充血坏死,无炎细胞浸润;内毒素组肝组织有点片状坏死,结构不清,肝细胞破裂,细胞核溶解,激光照射后的实验组有很少的点状坏死,程度比内毒素组轻。2.10各组孕鼠胎盘组织学观察:生理盐水组和生理盐水照射组胎盘蜕膜带变薄,主要由纤维性成分组成。基带为数层滋养叶巨细胞及少量糖原细胞组成的网络样结构,母血从中通过进入迷路带。迷路带为终末绒毛吻合成网,形成迷路样结构,网眼为母血间隙,是母血与胎儿血进行物质交换的地方。内毒素组蜕膜带肿胀增厚,炎性细胞浸润;基带滋养叶巨细胞增生,空泡化细胞岛增多,基带增厚;迷路带滋养叶细胞增生肥大,部分水肿,血间膜增厚,激光照射后的实验组以上情况减轻。2.11各组孕鼠肺组织学观察:生理盐水组和生理盐水照射组肺组织结构正常,肺泡腔大小正常,内毒素组肺泡隔增厚且水肿,肺泡腔变小,肺泡壁内血管扩张,有红细胞渗出到肺泡内,经过激光照射后实验组以上情况减轻。2.12各组孕鼠心肌组织学观察:生理盐水组及生理盐水照射组心肌细胞排列规则,结构正常,肌细胞间有小血管,内毒素组心肌间质有明显水肿,肌细胞间血管减少,但心肌细胞未见水肿、坏死等改变,经过激光照射后实验组水肿减轻。2.13各组孕鼠脑组织学观察:四组孕鼠脑组织观察没有什么差别,未见明显水肿、充血、出血、坏死等病理改变。【结论】1、妊娠中期单次低剂量内毒素尾静脉注射可以使孕鼠血压升高、尿蛋白增加、肝肾生化指标升高及胎盘和仔鼠重量降低,同子痫前期的临床症状有相似的表现,且与现有的确定子痫前期模型的标准一致,可以认为建模成功。2、在建立模型过程中,除了确定子痫前期的以上指标外,我们还发现了模型组血清TNF-α升高、肝、肾、肺、心及胎盘组织的形态学改变。3、低能量激光心前区照射对子痫前期大鼠模型有治疗效果,可拮抗内毒素引起的孕鼠血压升高、尿蛋白增加、肝肾生化指标改变及仔鼠的生长发育迟缓,且未发现对生理盐水对照组孕鼠及仔鼠的损害,证明了低能量激光照射做为物理疗法的优越性。4、我们还观察到低能量激光照射降低了模型组血清TNF-α,并且肝、肾、肺、心及胎盘组织的病理形态学改变得到了改善。因此,本研究结果为低能量激光照射应用于临床上预防和治疗子痫前期提供了动物实验支持。