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精子发生包括精原细胞的增殖与分化,减数分裂和精子细胞的变形成熟等过程,受到转录因子、组蛋白修饰和非编码RNA等表观调控因子调控。近期研究表明m6A是真核生物mRNA上最丰富的一种化学修饰,参与调控mRNA剪接,降解以及翻译等代谢过程,从而调控基因的表达;另据报道,m6A修饰参与精子发生的调控。FTO作为第一个被发现的m6A去甲基化酶,通过调控m6A修饰水平参与调控脂肪细胞的分化,癌细胞的增殖。MA2作为甲氯芬那酸(meclofenamic acid,MA)的乙酯形式,可以有效的竞争性结合到FTO的活性中心,从而抑制FTO的m6A去甲基化酶活性。为探究m6A修饰对精原细胞增殖的调控作用,本研究选择小鼠B型精原细胞和初级精母细胞之间阶段来源的GC-1 spg细胞作为研究对象,采用western blot、qRT-PCR、细胞流式、EdU、m6A dot blot等方法研究m6A对GC-1 spg细胞增殖的调控作用;此外,构建双荧光报告系统并验证m6A报告质粒的功能。获得结果如下:1、MA2处理不影响FTO蛋白的表达,mRNA的m6A修饰水平在MA2处理后显著上调,并且m6A修饰水平的增加与MA2处理浓度呈正相关。2、MA2处理导致GC-1 spg细胞活性的降低,多核细胞数目的增加,但是TUNEL阳性细胞比例没有改变;同时,Cleaved PARP、Cleaved Caspase-3,Bax和Bcl2的蛋白表达无显著变化。3、MA2处理GC-1 spg细胞导致EdU阳性细胞比例的下降,和增殖标记基因PCNA和ki67表达的下调。另外,MA2处理诱导GC-1 spg细胞周期G1/S阻滞。4、查询在线数据库(http://mirlab.sysu.edu.cn/rmbase/)得到含有m6A修饰的细胞周期调控基因;进一步的检测表明MA2处理上调CDK8的表达,但是下调CDK1,CDK2,CDK7,CDK9和CDK12的mRNA表达。5、针对CREBBP基因3’UTR区的3个m6A修饰位点成功构建了CREBBP-m6A报告系统,结果表明细胞中mCherry的荧光强度与m6A修饰水平呈负相关。构建了CDK2基因3’UTR m6A修饰位点的荧光报告质粒,并验证了CDK2 3’UTR区的m6A修饰可以调控CDK2转录本的表达。综上,通过FTO抑制剂MA2处理GC-1 spg细胞,增加精原细胞中mRNA的m6A修饰,并调节细胞周期调控基因的表达,进而诱导细胞周期G1/S阻滞,抑制细胞增殖。此外,建立了以CREBBP-m6A报告质粒为基础的m6A修饰水平变化的检测系统。