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多年生黑麦草是一种重要的冷季型草坪草,近年来全球水分紧缺,土壤盐化、次生盐渍化不断加剧,而种植抗旱、耐盐的草坪草能减少水分蒸发,抑制盐碱地土壤返盐,还可以用含一定盐分的水来灌溉,节省水资源。同时在北方及过渡地带,许多草坪草品种都遭受到不同程度冻害,严重影响草坪景观。本研究的目的是通过基因工程的方法将水稻OsNHX1和拟南芥AtDREB1A基因转入黑麦草,提高其耐盐、耐低温或抗旱能力。 对多年生黑麦草再生及根癌农杆菌介导的转化体系研究发现,6个品种黑麦草种子都能诱导出愈伤组织,通过胚性愈伤组织分化再生植株。但激素及添加浓度对不同品种愈伤组织诱导率及分化率影响显著。黑麦草种子再生植株的最适激素条件是愈伤组织诱导添加9mg/L2,4-D,胚性愈伤组织的诱导添加3mg/L2,4-D,分化过程添加0.1mg/L 2,4-D和0.1mg/L6-BA。生根培养基不添加任何激素。在最适培养条件下筛选出愈伤诱导率和分化率最高的品种TopGun。后在最适再生条件下,对影响根癌农杆菌介导转化效率的两个因素进行了研究,发现在摇菌和共培养过程添加200μM乙酰丁香酮及转化前将部分胚性愈伤组织于含0.4mol/L甘露醇渗透培养基上预培养12h,能提高转化效率达19.39%。 利用建立的根癌农杆菌转化体系将水稻OsNHX1基因、拟南芥AtDREB1A基因转入了多年生黑麦草。 水稻OsNHX1基因转化黑麦草得到4个转基因株系,PCR及Southern blotting鉴定表明,OsNHX1基因成功插入黑麦草基因组中。抗盐性鉴定表明,转基因株系比野生型抗盐能力显著提高,盐胁迫下,转基因株系比野生型积累了较高的Na~+、K~+及Pro含量。 拟南芥AtDREB1A基因转化黑麦草得到的转基因株系与野生型相比,植株生长矮小,叶绿素含量增加,叶色加深。表型发生明显改变。而且转基因株系耐低温能力提高。丙二醛含量测定表明,转基因株系丙二醛含量比对照低,膜系统受伤害程度较轻。 本文利用根癌农杆菌介导的方法将OsNHX1和AtDREB1A基因转入多年生黑麦草,获得了抗盐、耐低温能力明显提高的转基因株系。为草坪草的改良奠定基础,必将加快草坪草的育种进程,带来显著的经济效益和社会效益。