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阿片类药物(opioids)是临床麻醉中最常用的超短效镇痛药。但其导致的痛觉过敏发生率较高,这使阿片类药物的使用受到限制。瑞芬太尼(remifentanil)起效快且清除迅速,被广泛用于全身麻醉的镇痛,但研究证实瑞芬太尼所致痛觉过敏(remifentanil-induced hyperalgesia,RIH)的发生率明显高于其他阿片类药物。目前RIH的发生机制尚不明确,缺乏疗效确切的药物,因此有必要进一步明确RIH发生的具体分子机制。钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ,Ca MKⅡ)是突触后致密成分的重要蛋白质组分,它能感受突触后钙离子水平的变化,并能通过自磷酸化维持长时活性,在调节谷氨酸能突触可塑性、长时程增强(long-term potentiation,LTP)和学习记忆中发挥重要作用。组蛋白去乙酰化酶4(histone deacetylase 4,HDAC4)是一类蛋白酶,其调控的组蛋白去乙酰化是染色体重组对基因转录实现后天性调控的重要过程。在脊神经结扎所致的病理性神经痛痛觉过敏大鼠模型中,脊髓磷酸化的HDAC4及细胞质中的HDAC4表达明显升高。给予N-甲基-d-天冬氨酸(N-methyl-d-aspartate,NMDA)受体拮抗剂或Ca MKⅡα抑制剂,可导致HDAC4从细胞质向细胞核间穿梭(shuttling),显著影响与突触可塑性相关的基因转录过程。基于以上背景,该课题假说为:瑞芬太尼可能通过增加NMDA受体2B亚单位(NR2B subunit of NMDA receptors,NR2B)膜上表达,进而增强NMDA受体介导的钙电流,激活Ca MKⅡα,促使HDAC4磷酸化,并由细胞核内向细胞质中穿梭(shuttling),促使影响突触可塑性的目的基因转录和表达,进而诱发痛觉过敏。本实验通过制作大鼠切口痛-瑞芬太尼痛觉过敏模型,探讨NR2B-Ca MKⅡα-HDAC4在RIH中的调控机制,从而为瑞芬太尼痛觉过敏的临床防治提供新思路。目的通过评价RIH大鼠脊髓背角NR2B亚单位表达及膜上转运、Ca MKⅡα活性及HDAC4活性的变化,探讨该通路在瑞芬太尼诱发痛觉过敏现象中的可能机制;通过鞘内注射NR2B选择性拮抗剂Ro25-6981,探讨其对瑞芬太尼痛觉过敏大鼠疼痛行为学影响及脊髓背角Ca MKⅡα磷酸化表达、NR2B/Ca MKⅡα复合物表达的变化、HDAC4活性改变的影响;通过鞘内注射Ca MKⅡα抑制剂KN-93,探讨其对瑞芬太尼痛觉过敏大鼠疼痛行为学影响及HDAC4活性改变的影响;通过鞘内注射HDAC4选择性抑制剂LMK235,探讨其对瑞芬太尼痛觉过敏大鼠疼痛行为学和HDAC4活性的影响;通过鞘内注射NR2B选择性拮抗剂Ro25-6981、Ca MKⅡα抑制剂KN-93和HDAC4选择性抑制剂LMK235,探讨这三个因素对RIH大鼠脊髓背角树突棘的影响。方法一.雄性SD大鼠(8~12周)60只,随机分为5组(n=12):C组(假手术+生理盐水组):施行假手术,通过尾静脉以0.1 ml·kg-1·min-1速率持续输注生理盐水,1h;G组(假手术+甘氨酸组):假手术,尾静脉输注甘氨酸溶液0.1 ml·kg-1·min-1,1h;R组(瑞芬太尼组):尾静脉输注瑞芬太尼1.0μg·kg-1·min-1,1h;I组(切口痛组):通过尾静脉以0.1 ml·kg-1·min-1速率持续输注生理盐水,10min后建立Brennan切口痛模型;IR组(Remifentanil+切口痛组):通过尾静脉以1.0μg·kg-1·min-1速率持续输注瑞芬太尼,10min后制作大鼠Brennan切口痛模型。每组取6只大鼠,分别在以下时间点:输注前1d(基础值)、输注10min后的2h、6h、1d、2d、3d、5d和7d,测定热刺激缩足潜伏期(paw withdrawal latency,PWL)和机械刺激缩足阈值(paw withdrawal threshold,PWT);于输注后2 d,每组取6只大鼠处死并取脊髓背角L4-6节段,采用免疫印迹(Western blot)测定大鼠脊髓背角NMDA受体NR2B亚单位表达及膜上转运水平的变化、Ca MKⅡα活性的改变及HDAC4活性的变化。二.雄性SD大鼠(8~12周)48只,随机数字表法分为4组(n=12):C组:施行假手术,通过尾静脉以0.1 ml·kg-1·min-1速率持续输注生理盐水,1h;IR组:按照1.0μg·kg-1·min-1剂量,经尾静脉输注瑞芬太尼,输注10min后建立Brennan切口痛模型。C+Ro组(假手术+NR2B拮抗剂Ro25-6981组):施行假手术,通过尾静脉以0.1 ml·kg-1·min-1速率持续输注生理盐水,1h,输注10min前鞘内给予Ro25-6981 100nmol;IR+Ro(切口痛+瑞芬太尼+NR2B拮抗剂Ro25-6981组):鞘内注射Ro25-6981 100nmol,10min后通过尾静脉以1.0μg·kg-1·min-1速率持续输注瑞芬太尼,10min后制作大鼠Brennan切口痛模型;探讨抑制NR2B表达及膜上转运的改变对RIH大鼠脊髓背角Ca MKⅡα活性、NR2B/Ca MKⅡα复合物表达及HDAC4活性的影响;三.雄性SD大鼠(8~12周)48只,随机数字表法分为4组(n=12):C组:施行假手术,通过尾静脉以0.1 ml·kg-1·min-1速率持续输注生理盐水,1h;IR组:按照1.0μg·kg-1·min-1速率,经尾静脉输注瑞芬太尼,输注10min后建立Brennan切口痛模型。C+K组(假手术+Ca MKⅡα抑制剂KN-93组):建立假手术模型,尾静脉输注生理盐水10min前鞘内给予KN-93 100nmol;IR+K组(切口痛+瑞芬太尼+Ca MKⅡα抑制剂KN-93组):鞘内注射KN-93100nmol,10min后通过尾静脉以1.0μg·kg-1·min-1速率持续输注瑞芬太尼,10min后制作大鼠Brennan切口痛模型;应用免疫印迹Western blot和免疫共沉淀技术,探讨抑制脊髓背角Ca MKⅡα活性对切口痛-瑞芬太尼大鼠术后热痛敏和机械痛敏表现、NR2B/Ca MKⅡα复合物表达及HDAC4活性的影响。四.雄性SD大鼠(8~12周)72只,随机数字表法分为6组(n=12):C组:行假手术,通过尾静脉以0.1 ml·kg-1·min-1速率持续输注生理盐水,1h;IR组:经尾静脉输注瑞芬太尼1.0μg·kg-1·min-1,输注10min后建立Brennan切口痛模型;C+L3组(假手术+生理盐水组+大剂量HDAC4选择性抑制剂LMK235组):建立假手术模型,输注生理盐水前10min经鞘内给予LMK235100 nmol,10μl;IR+L1组、IR+L2组、IR+L3组:经尾静脉输注瑞芬太尼1.0μg·kg-1·min-1,输注前10min,经鞘内分别给予LMK235 10 nmol、30 nmol、100nmol,均为10μl,输注瑞芬太尼10min后建立Brennan切口痛模型;探讨抑制脊髓背角HDAC4活性对切口痛-瑞芬太尼大鼠术后热痛敏和机械痛敏表现,应用Western blot,检测对HDAC4磷酸化表达的影响。五.雄性SD大鼠(8~12周)30只,随机分为5组(n=6):C组:同实验一;IR组:通过尾静脉以1.0μg·kg-1·min-1速率持续泵注瑞芬太尼,输注10min后建立Brennan切口痛模型;IR+Ro组:瑞芬太尼输注前鞘内注射Ro25-6981 100nmol,10μL;IR+K组:鞘内注射KN93,100nmol,10μL;IR+L3组,鞘内给予LMK235 100 nmol,10μl;以上三组鞘内给药10min后开始输注瑞芬太尼,10min后建立Brennan切口痛模型。输注瑞芬太尼后2 d,分别处死各组大鼠,提取脊髓背角的L4-6节段,采用高尔基染色试剂盒所述方法,检测脊髓背角树突棘长度和数量的改变。结果一与C组相比,G组PWT和PWL无显著差异,I、R和IR组的PWT和PWL均降低;NR2B表达及膜上转运增加;Ca MKⅡα活性升高;NR2B/Ca MKⅡα复合物表达增加,HDAC4活性增加(P<0.01)。与I组相比,R组各项指标无显著差异;IR组的PWT和PWL均显著降低;NR2B表达及膜上转运增加;Ca MKⅡα活性升高;NR2B/Ca MKⅡα复合物表达增加,HDAC4活性增加(P<0.01)。二与C组比较,C+Ro组PWT和PWL无显著差异,IR、IR+Ro组的PWT和PWL显著降低;NR2B表达及膜上转运增加;Ca MKⅡα活性升高;NR2B/Ca MKⅡα复合物表达增加,HDAC4活性增加(P<0.01)。与IR组相比,IR+Ro组的PWT和PWL显著升高;NR2B表达及膜上转运降低;Ca MKⅡα活性降低;NR2B/Ca MKⅡα复合物表达显著减少,HDAC4活性降低(P<0.01)。三与C组比较,C+K组PWT和PWL无显著差异,IR、IR+K组的PWT和PWL显著降低;Ca MKⅡα活性升高;NR2B/Ca MKⅡα复合物表达增加,HDAC4活性增加(P<0.01)。与IR组相比,IR+K组的PWT和PWL显著升高;Ca MKⅡα活性降低;NR2B/Ca MKⅡα复合物表达显著减少,HDAC4活性降低(P<0.01)。四与C组比较,C+L3组PWT和PWL无显著差异,IR、IR+L1、IR+L2、IR+L3组的PWT和PWL明显降低;HDAC4活性增加(P<0.01)。与IR组相比,IR+L2、IR+L3组的PWT和PWL显著升高,HDAC4磷酸化的表达呈剂量依赖性减少(P<0.05)。五与C组比较,其余四组大鼠脊髓背角树突棘的长度和数量均明显增加(P<0.05)。与IR组对照比较,IR+Ro、IR+K和IR+L3组大鼠脊髓背角树突棘的长度和数量显著降低(P<0.05)。结论术中持续输注瑞芬太尼可明显加重大鼠足底切口手术导致的术后机械性痛觉过敏和热痛敏情况;RIH大鼠脊髓背角NR2B表达及膜上转运增加,Ca MKⅡα活性升高,NR2B/Ca MKⅡα复合物表达增加,HDAC4活性增加;抑制脊髓水平NR2B可缓解大鼠瑞芬太尼痛觉过敏程度,其机制可能与脊髓背角Ca MKⅡα及HDAC4活性降低相关;抑制脊髓水平Ca MKⅡα,可显著缓解大鼠瑞芬太尼痛觉过敏程度,其机制可能与抑制HDAC4活性相关;选择性抑制脊髓水平HDAC4,可显著缓解大鼠瑞芬太尼痛觉过敏程度。瑞芬太尼麻醉复合手术后可引起脊髓背角NR2B膜上表达增加,导致Ca MKⅡα及HDAC4活性增加,进而调控树突棘数量及结构重塑,可能是RIH发生的关键环节。