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结核病是威胁全球健康的慢性传染性人畜共患病,目前缺乏有效的预防和根治方法。目前认为结核病的发病机理是:致病性结核分支杆菌通过呼吸系统进入体内,与肺部巨噬细胞膜表面受体结合后形成吞噬小体,通过获取铁等金属离子,产生大量活性酶类,从而抵抗巨噬细胞的杀伤作用,在细胞内寄生,从而难以治愈。Nramp1蛋白的功能之一是将金属离子从吞噬体内腔转运到细胞质内,通过限制金属离子限制病菌生产活性酶的能力,阻止结核分支杆菌的增殖。通过转基因手段来增强羊Nramp1基因过表达,培育抗病种群,可成为控制羊结核病一个新的切入点。Cre/loxp位点特异性重组系统由Cre重组酶和loxp位点两部分组成,Cre重组酶不仅具有催化活性,而且与限制酶相似,能识别特异的DNA序列,即loxP位点,使loxP位点间的基因序列被删除或重组。该定点整合方法主要有以下优点:(1)外源基因能够准确地整合到宿主染色体的特定位点;(2)减少转基因生物中外源基因的拷贝数,整合上的外源基因多数都是未发生重排的单拷贝。本研究主要通过Cre/loxp重组酶系统将Nramp1基因定点整合入人溶菌酶转基因山羊细胞内,从而通过核移植方法制备抗结核分支杆菌的Nramp1转基因山羊。首先分离了人溶菌酶高表达转基因山羊耳成纤维细胞3-376♂,其基因组内包括盒式交换系统loxp1-Neo-Tk-loxp表达框架,并且此框架中loxp序列为突变型,即将野生型loxp位点的反向重复序列“ATAAC”突变为“CACCT”。人工合成含有Nrampl基因的表达框架,第132位氨基酸由异亮氨酸(I)突变为苏氨酸(T),此突变蛋白特异性表达于巨噬细胞中,具有抗胞内菌活性,尤其适用于预防和治疗胞内菌引起的感染。通过酶切,连接等步骤得到框架为 loxp2-polyA-Nrampl-Purocoda-loxp 的Nramp1 定点表达载体质粒 pTM-Nramp1。将上述pTM-Nramp1质粒与pBS185质粒共同转染3-376♂细胞,嘌呤霉素抗性筛选得到22株克隆,经PCR及测序鉴定,其中3株目的基因已经整合到预定位点,为定位整合阳性细胞株,整合效率为13.6%(3/22),挑取其中状态良好的11号细胞作为体细胞核移植的核供体。挑选50头2岁左右健康母羊作为供体羊,同步发情,超数排卵处理后获得卵母细胞总数为155个,移核卵数111个,融合后获得重构胚105株,融合率94.59%(105/111),移植入13头受体母羊输卵管内。35天后进行B超妊娠检查,共检查到6头母羊出现孕囊,怀孕率为46%(6/13)。47天时剖腹取出一个胎儿,155天顺产获得一只健康公羊,经PCR方法和测序鉴定,此胎儿和新生小羊均为Nramp1定位整合转基因公羊,该公羊目前仍然健康,这为Nramp1转基因羊的扩繁奠定坚实的基础。