论文部分内容阅读
目的:临床研究表明癫痫患者除癫痫发作症状外,还并存严重的认知和行为障碍,极大影响患者生活质量。除了基础病因以及抗癫痫药物的副作用外,痫性发作本身也是癫痫患者认知损害的主要原因。Arc/Arg3.1是一种即刻早期基因,可以对多种生理学和病理学刺激作出快速反应,在突触可塑性和记忆加工储存过程中起着重要作用。AMPA受体是一种离子型谷氨酸受体,参与突触可塑性和突触的传递,与长时程增强(long term potentiation, LTP)密切相关。本实验通过戊四氮(pentylenetetrazole,PTZ)建立稳定的慢性癫痫动物模型,并给予NMDA受体拮抗剂美金刚(memantine,MMT)加以干预,应用Morris水迷宫观察癫痫大鼠学习记忆变化,利用Western blot及RT-PCR方法检测Arc/Arg3.1和AMPA受体GluR1蛋白及转录水平的变化,并进一步研究美金刚的作用,探讨癫痫对认知功能影响的分子机制。方法:选用健康雄性SD大鼠,经两次Y-迷宫筛选合格后获得110只大鼠,随机分四组,NC组(20只)大鼠每日腹腔注射生理盐水3.5 ml/kg,共44d。PTZ组(35只)每日腹腔注射1% PTZ 35 mg/kg,连续44d,自给药第31天起,每日PTZ注射前15 min腹腔注射生理盐水3.5 ml/kg,共14 d。PTZ+MMT组(35只)每日腹腔注射1% PTZ 35 mg/kg,连续44 d,自给药第31天起,每日PTZ注射前15 min分别腹腔注射MMT 10 mg/kg,共14d。MMT组(20只)每日腹腔注射生理盐水3.5 ml/kg,连续44d,自第31天每日生理盐水注射前给予MMT 10 mg/kg,共14d。造模成功后采用Morris水迷宫进行大鼠学习和记忆成绩的测试。运用反转录多聚酶链反应(RT-PCR)方法和Western Blot方法分别测定大鼠海马Arc/Arg3.1和GluR1 mRNA和蛋白的水平变化。结果:1.行为学观察PTZ组大鼠在注射PTZ后第6～10天起开始出现凝视、点头、反复洗脸动作、面部及头部抽搐等,以后发作症状逐日加重,于给药第18～24天出现全身肌阵挛、双前肢抬起,最终发生全身强直-阵挛性发作,达到RacineⅣ～Ⅴ级的点燃标准,每次强直-阵挛发作持续数分钟不等。大鼠连续三次RacineⅣ～Ⅴ级发作后被认为点燃成功,共有大鼠25只完全点燃。PTZ+MMT组:应用PTZ 30天时大鼠表现同单纯PTZ组,共有27只大鼠完全点燃;后14天PTZ注射前给予MMT,大鼠癫痫发作Ⅳ～Ⅴ级程度基本未变,但发作持续时间和发作后缓解时间均缩短。NC组和单纯MMT组均无癫痫发作表现。2.Morris水迷宫检测结果定位航行实验结果:每日逃避潜伏期取其平均值进行比较,结果显示(1)实验第1天,四组大鼠逃避潜伏期比较无统计学意义(P>0.05);(2)实验第2天,各组逃避潜伏期均比第一天明显缩短,与NC组的逃避潜伏期(7.61±2.14)s比较,PTZ组和MMT组大鼠的逃避潜伏期(18.60±6.13)s及(14.4±4.37)s明显延长(P<0.01);PTZ+MMT组的逃避潜伏期(8.4±1.96)s较PTZ组缩短(P<0.05)。(3)实验第3天,与NC组(6.37±1.91)s比较,PTZ组大鼠的逃避潜伏期(16.1±3.19)s延长(P<0.01),MMT组(10.4±3.15)s长于NC组(P<0.05);PTZ+MMT组逃避潜伏期(7.50±2.57)s短于PTZ组(P<0.05)。(4)实验第4天,与NC组(4.71±1.88)s比较,PTZ组大鼠的逃避潜伏期(11.4±2.51)s延长(P<0.05);PTZ+MMT组逃避潜伏期(5.8±1.87)s短于PTZ组(P<0.05),MMT组逃避潜伏期长于NC组,但无统计学意义。空间探索试验结果:PTZ组大鼠120 s内穿越平台区域的次数(7.01±1.13)明显低于NC组(13.5±1.77)(P<0.01);PTZ+MMT组大鼠120s内穿越平台区域的次数(11.83±1.03)与PTZ组比较次数明显增多(P<0.01),但与NC组比较无统计学意义(P>0.05);MMT组大鼠120 s内穿越平台区域的次数比NC组少(P<0.05)。在平台象限的游泳时间为:NC组(51.07±5.59)s,PTZ组(45.16±3.66)s,PTZ+MMT(53.84±4.27)s,MMT组(56.18±3.93)s,四组比较无显著性差异(P>0.05)。3.Arc mRNA的表达PTZ组大鼠海马Arc/β-actin mRNA表达(0.291±0.032)与NC组(0.776±0.039)相比降低,两者有显著性差异(P<0.01),PTZ+MMT组(0.701±0.038)、MMT组(0.781±0.077)与NC组比较无显著差异,PTZ+MMT组高于PTZ组,差异有统计学意义(P<0.01)。4.GluR1 mRNA的表达PTZ组大鼠海马GluR1/β-actin mRNA表达(1.535±0.056)与NC组(0.934±0.039)相比升高,两者有显著性差异(P<0.01),PTZ+MMT组(0.953±0.047)与MMT组(0.962±0.052)与NC组比较无显著差异,PTZ+MMT组低于PTZ组,差异有统计学意义(P<0.01)。5.Arc蛋白的表达PTZ组大鼠海马Arc/ GAPDH蛋白表达(0.131±0.043)与NC组(0.352±0.061)相比降低,两者有显著性差异(P<0.05),PTZ+MMT组(0.347±0.058)、MMT组(0.324±0.049)与NC组比较无显著差异,PTZ+MMT组高于PTZ组,差异有统计学意义(P<0.05)。与大鼠海马Arc mRNA表达变化相吻合。6.GluR1蛋白的表达PTZ组大鼠海马GluR1/ GAPDH mRNA表达(4.922±0.289)与NC组(2.451±0.143)相比升高,两者有显著性差异(P<0.01),PTZ+MMT组(1.967±0.259)、MMT组(2.319±0.280)与NC组比较无显著差异,PTZ+MMT组低于PTZ组,差异有统计学意义(P<0.01)。与大鼠海马GluR1 mRNA表达变化相吻合。结论:本实验建立的戊四氮点燃慢性癫痫大鼠模型存在学习和记忆能力缺损。PTZ致痫大鼠海马组织Arc蛋白及其mRNA表达水平均降低,GluR1蛋白及其mRNA表达水平均升高,提示Arc和GluR1可能参与癫痫后认知功能障碍的发病机制。美金刚可能通过调节癫痫大鼠海马组织Arc和GluR1蛋白及mRNA表达水平改善癫痫大鼠学习和记忆能力。