随着我国社会已进入人口老龄化阶段,老年痴呆症(AD)的发病率也逐年增高,目前,全世界老年性痴呆症患者人约有5000万人,并且不断趋于年轻化,该病的病因目前尚无确切定论,发病机理有多种假说,老年性痴呆症不仅是一个医学难题,而且将成为一个突出的社会问题。“定志小丸”(DX-9386)源于唐代药王孙思邈的《备急千金方》。处方由人参、茯苓、石菖蒲和远志四味中药组成,四药合用,共奏补养心脾、祛痰化湿、益智定志之功,为中医治疗老年痴呆症的基础方剂。原方为大蜜丸剂,日服用量大,不便服用,我们采用现代工艺方法,对其进行了中药现代化研究。现代药理学研究表明,方中药材起作用的有效成分为人参皂苷、远志皂苷、人参多糖、茯苓多糖和石菖蒲的挥发油等成分。根据这些成分的性质,结合祖国中医理论,我们以总多糖和总皂苷的含量为指标,结合药理实验结果,通过L9(3)4正交试验,确立了“定志小丸”的提取工艺,并利用醇沉和大孔树脂柱层析进行纯化,降低了出膏率,最大限度地提出了有效成分,提高了有效成分的含量,制定了稳定可控的工艺控制指标,并进行了初步的药效学试验。远志酸是2005年版中国药典远志含量测定的法定对照品,但目前国内无对照品供应。为制定“定志小丸”质量标准的需要,我们从远志总皂苷的水解产物中分离得到了远志酸及其三个类似物,经光谱鉴定与远志酸结构一致,纯度检查含量均在98%以上,达到了中药对照品要求。目的:研究“定志小丸”的提取纯化工艺,制定工艺质量控制标准,进行初步的药效学试验。远志药材水解产物的分离,制备远志酸对照品,为新药申报提供对照品。方法:第一部分①“定志小丸”提取工艺研究:按照中国药典(2005年版)标准,选用合格药材,通过单因素对比试验,确定石菖蒲挥发油提取条件;以总多糖、总皂苷、出膏率及药效学结果为评价指标,进行综合评分,确定提取溶剂;在全方提取条件优化中首先通过单因素试验考察提取次数,然后通过L9(34)正交试验,考察提取时间、溶剂倍数和稀醇浓度的影响,最终确定最佳工艺参数。②“定志小丸”除杂工艺研究:通过L9(34)正交试验优化醇沉条件,对“定志小丸”提取液进行第一次醇沉除杂;通过大孔树脂动态吸附试验,选择大孔树脂型号,考察大孔树脂吸附容量、上样浓度、洗脱溶剂及溶剂用量,确定大孔树脂纯化工艺参数,利用大孔树脂对醇沉后的提取液进行二次除杂。③建立“定志小丸”提取、除杂工艺质量控制指标:可见-紫外分光光度法测定总多糖和总皂苷。④“定志小丸”初步药效学试验:以小鼠跳台试验和生化指标SOD、AChE、MDA为指标,评价提取物对老龄小鼠的抗氧化、益智作用。第二部分单体成分的提取、分离和结构鉴定:远志药材用稀醇提取,正丁醇萃取,大孔吸附树脂富集得到总皂苷,总皂苷酸水解后,用硅胶色谱柱、制备液相等方法分离得单体化合物,利用UV、NMR、MS等波谱鉴定技术,确定单体化合物结构。结果:第一部分①提取工艺条件:石菖蒲挥发油最佳提取条件为8倍量的水浸泡12小时,水蒸气蒸馏提取6小时,用石油醚(60-90℃)萃取,石菖蒲挥发油可提取完全;全方最佳提取工艺为以8倍量50%乙醇回流提取2次,每次1.5小时。②最佳除杂条件:将“定志小丸”提取液浓缩到1g生药/mL,加95%乙醇至含醇量为75%,进行醇沉,醇沉上清液浓缩到0.4g生药/mL,上D101大孔树脂柱进行二次除杂,分别用水、30%和60%醇进行梯度洗脱,收集水和60%醇洗脱液部分,减压浓缩。③提取、除杂工艺质量控制方法:用紫外-可见分光光度法测定的指标成分总多糖和总皂苷能充分反映方中有效成分含量和产品的内在质量,方法简单、可靠、可控。③药效学试验表明,“定志小丸”提取物可以明显减少小鼠跳台试验的错误次数,延长潜伏期,生化指标SOD、AChE、MDA测定结果表明具有统计学意义。第二部分从远志皂苷水解产物中分离得到了四个单体化合物,经波谱分析鉴定,化合物的结构分别为:化合物I为远志酸,化合物II为远志皂苷元,化合物III为远志酸-3-O-β-D-葡萄糖苷,化合物IV为远志皂苷元-3-O-β-D-葡萄糖苷。结论:通过正交试验优化的提取工艺最大程度保留了各种有效成分;一次醇沉和二次大孔树脂纯化工艺,既避免多糖等有效成分的损失,又降低了出膏率,减少制剂的用量,达到了现代中药制剂的要求。从远志皂苷水解产物中分离得到四个单体化合物,其中I(远志酸)为2005年版药典远志药材含量测定项下规定的法定对照品,为远志药材及制剂质量控制提供了对照品。