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前言感音神经性耳聋是耳科学重点研究领域之一，自身免疫性内耳病（autoimmune inner ear disease，AIED）被认为是感音神经性耳聋中唯一可望治愈的疾病，因此受到广泛重视。细胞凋亡是在基因控制下的细胞主动死亡，它对细胞的增殖、器官的发生和器官自身平衡的维持有重要意义。许多病理因素可以诱发内耳细胞发生凋亡，但内耳的免疫反应是否可造成细胞凋亡，细胞凋亡及其相关蛋白在自身免疫病中是否也有重要的作用，国内尚鲜有报道。本研究拟应用Ⅱ型胶原（typeⅡcollagen，CⅡ）建立自身免疫性内耳疾病的动物模型，脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记技术（ter minal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL）和SABC免疫组化法，检测内耳细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bcl-2与Bax在AIED大鼠耳蜗中的表达，了解细胞凋亡在AIED的产生和发展中的作用。材料与方法材料：取耳廓反射正常的健康雌性SD大鼠60只，随机分3组。实验组30只，予Ⅱ型胶原全身免疫；佐剂组15只，予以佐剂；对照组15只，予以等量生理盐水。方法：（1）DPOAE检测：各组大鼠于免疫前及免疫后10％水合氯醛（3ml/kg）腹腔注射麻醉，测试1、2、4、6、8KHz处的DPOAE幅值。（2）耳蜗冰冻切片标本的制备：动物麻醉状态下，先后用生理盐水及4％多聚甲醛心脏灌流固定，分离耳蜗，行内灌流后置于相同固定液中4℃24小时。PBS漂洗后置于甲酸-甲酸钠溶液中室温下脱钙10天。PBS洗涤后移入30％蔗糖溶液4℃过夜，沉降后行OCT包埋，恒冷箱切片机沿平行蜗轴方向连续切片，片厚10um。（4）TUNEL法检测凋亡：冰冻切片以3％H2O2孵育，加入标记缓冲液及生物素化抗地高辛抗体37℃反应，DAB显色，梯度酒精脱水，封片。SABC免疫组化法检测Bcl-2与Bax：冰冻切片，滴加一抗（兔抗鼠Bcl-2和Bax单克隆抗体）及二抗（生物素化羊抗兔IgG）孵育后，DAB显色，封片。以显微图象分析系统计算出TUNEL及Bcl-2与Bax阳性反应物的的平均光密度值。所有数据用均数±标准差（（?）±s）表示，进行t检验和单因素方差分析。实验结果1．免疫后实验组DPOAE幅值在各频率均较免疫前下降，且有显著性差异（P<0.01），而佐剂组和对照组与免疫前比较，均无显著性差异（P>0.05）。2．实验组听力损失耳的Corti器外毛细胞和支持细胞、螺旋神经节、血管纹均可见TUNEL阳性细胞，而照组和佐剂组切片中上述部位仅见极少量的阳性细胞。3．实验组听力下降耳Corti器、螺旋神经节细胞、血管纹Bcl-2蛋白表达阴性，对照组及佐剂组在上述部位Bcl-2蛋白表达阳性。而实验组Corti器、螺旋神经节细胞和血管纹Bax蛋白表达阳性，对照组螺旋神经节细胞、血管纹Bax蛋白表达弱阳性，Corti器表达阴性。讨论本研究应用皮下注射牛Ⅱ型胶原的方法诱导内耳免疫反应，免疫后实验组部分大鼠出现听力下降，累及单耳或双耳，这与AIED的临床发病特点相一致。并且免疫后大鼠血清循环免疫复合物明显升高，这说明内耳抗原在免疫大鼠后产生了抗体，在循环中形成了抗原抗体复合物，提示本实验用牛Ⅱ型胶原成功诱导了自身免疫内耳病的动物模型。细胞凋亡，是在基因调控下的一个严密完整的程序过程，其中Bcl-2基因蛋白家族是与细胞凋亡相关因素中最受关注的基因之一。本研究结果显示，实验组听力下降耳大鼠耳蜗Corti器的外毛细胞、血管纹和螺旋神经节均见TUNEL染色阳性细胞，而在对照组大鼠内耳的上述结构仅见极少量TUNEL染色阳性细胞，此结果说明内耳免疫反应诱导了这些细胞的DNA降解。本实验显示内耳免疫反应时，实验组耳蜗上述结构的Bcl-2反应阳性细胞显著减少，而Bax蛋白染色阳性的细胞显著增多，即Bax/Bcl-2的比率显著升高，结合TUNEL染色结果，证实了内耳免疫反应时存在细胞凋亡，并且Bcl-2蛋白家族在调节内耳免疫反应诱导的中起着关键作用，为阐明自身免疫性内耳病的发病机制开辟了新的思路。结论1、证实了牛Ⅱ型胶原可以诱发大鼠产生自身免疫性内耳病，造成鼠内耳形态结构和听觉功能的损伤。2、自身免疫性内耳病发病机制中Ⅱ型胶原起一定作用，但存在种系和个体差异。3、证实了内耳免疫反应可引起耳蜗毛细胞凋亡，凋亡相关蛋白Bcl-2与Bax在其中起了重要作用。