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前言感音神经性耳聋是耳科学重点研究领域之一,自身免疫性内耳病(autoimmune inner ear disease,AIED)被认为是感音神经性耳聋中唯一可望治愈的疾病,因此受到广泛重视。细胞凋亡是在基因控制下的细胞主动死亡,它对细胞的增殖、器官的发生和器官自身平衡的维持有重要意义。许多病理因素可以诱发内耳细胞发生凋亡,但内耳的免疫反应是否可造成细胞凋亡,细胞凋亡及其相关蛋白在自身免疫病中是否也有重要的作用,国内尚鲜有报道。本研究拟应用Ⅱ型胶原(typeⅡcollagen,CⅡ)建立自身免疫性内耳疾病的动物模型,脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记技术(ter minal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL)和SABC免疫组化法,检测内耳细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bcl-2与Bax在AIED大鼠耳蜗中的表达,了解细胞凋亡在AIED的产生和发展中的作用。材料与方法材料:取耳廓反射正常的健康雌性SD大鼠60只,随机分3组。实验组30只,予Ⅱ型胶原全身免疫;佐剂组15只,予以佐剂;对照组15只,予以等量生理盐水。方法:(1)DPOAE检测:各组大鼠于免疫前及免疫后10%水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉,测试1、2、4、6、8KHz处的DPOAE幅值。(2)耳蜗冰冻切片标本的制备:动物麻醉状态下,先后用生理盐水及4%多聚甲醛心脏灌流固定,分离耳蜗,行内灌流后置于相同固定液中4℃24小时。PBS漂洗后置于甲酸-甲酸钠溶液中室温下脱钙10天。PBS洗涤后移入30%蔗糖溶液4℃过夜,沉降后行OCT包埋,恒冷箱切片机沿平行蜗轴方向连续切片,片厚10um。(4)TUNEL法检测凋亡:冰冻切片以3%H2O2孵育,加入标记缓冲液及生物素化抗地高辛抗体37℃反应,DAB显色,梯度酒精脱水,封片。SABC免疫组化法检测Bcl-2与Bax:冰冻切片,滴加一抗(兔抗鼠Bcl-2和Bax单克隆抗体)及二抗(生物素化羊抗兔IgG)孵育后,DAB显色,封片。以显微图象分析系统计算出TUNEL及Bcl-2与Bax阳性反应物的的平均光密度值。所有数据用均数±标准差((?)±s)表示,进行t检验和单因素方差分析。实验结果1.免疫后实验组DPOAE幅值在各频率均较免疫前下降,且有显著性差异(P<0.01),而佐剂组和对照组与免疫前比较,均无显著性差异(P>0.05)。2.实验组听力损失耳的Corti器外毛细胞和支持细胞、螺旋神经节、血管纹均可见TUNEL阳性细胞,而照组和佐剂组切片中上述部位仅见极少量的阳性细胞。3.实验组听力下降耳Corti器、螺旋神经节细胞、血管纹Bcl-2蛋白表达阴性,对照组及佐剂组在上述部位Bcl-2蛋白表达阳性。而实验组Corti器、螺旋神经节细胞和血管纹Bax蛋白表达阳性,对照组螺旋神经节细胞、血管纹Bax蛋白表达弱阳性,Corti器表达阴性。讨论本研究应用皮下注射牛Ⅱ型胶原的方法诱导内耳免疫反应,免疫后实验组部分大鼠出现听力下降,累及单耳或双耳,这与AIED的临床发病特点相一致。并且免疫后大鼠血清循环免疫复合物明显升高,这说明内耳抗原在免疫大鼠后产生了抗体,在循环中形成了抗原抗体复合物,提示本实验用牛Ⅱ型胶原成功诱导了自身免疫内耳病的动物模型。细胞凋亡,是在基因调控下的一个严密完整的程序过程,其中Bcl-2基因蛋白家族是与细胞凋亡相关因素中最受关注的基因之一。本研究结果显示,实验组听力下降耳大鼠耳蜗Corti器的外毛细胞、血管纹和螺旋神经节均见TUNEL染色阳性细胞,而在对照组大鼠内耳的上述结构仅见极少量TUNEL染色阳性细胞,此结果说明内耳免疫反应诱导了这些细胞的DNA降解。本实验显示内耳免疫反应时,实验组耳蜗上述结构的Bcl-2反应阳性细胞显著减少,而Bax蛋白染色阳性的细胞显著增多,即Bax/Bcl-2的比率显著升高,结合TUNEL染色结果,证实了内耳免疫反应时存在细胞凋亡,并且Bcl-2蛋白家族在调节内耳免疫反应诱导的中起着关键作用,为阐明自身免疫性内耳病的发病机制开辟了新的思路。结论1、证实了牛Ⅱ型胶原可以诱发大鼠产生自身免疫性内耳病,造成鼠内耳形态结构和听觉功能的损伤。2、自身免疫性内耳病发病机制中Ⅱ型胶原起一定作用,但存在种系和个体差异。3、证实了内耳免疫反应可引起耳蜗毛细胞凋亡,凋亡相关蛋白Bcl-2与Bax在其中起了重要作用。