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生物主要通过转录调控来应对外界环境刺激与内在发育节律,植物自萌发以后便固驻一地,一生要经受众多的生物与非生物胁迫,同时基因组中大量的转座子和重复序列等所谓的垃圾DNA对机体也是一种潜在的内在“胁迫”,这些不利因素要求植物在基因组转录调控方面具备一套精确有效的调节机制。本论文第一部分选取红树为对象,研究了植物在高盐胁迫下转录调控的特点,第二部分采用拟南芥为模式,研究了表观遗传在转录沉默中的调控机制。
近年来发展起来的新一代测序技术带来的测序革命为我们在非模式物种中开展基因组学研究提供了基础。红树林是生长于热带、亚热带海岸潮间带的木本植物群落,其对于盐生环境具有高度的适应性,是一类极好的进化与生态功能基因组学的研究模型。我们首先使用Solexa测序技术测定了红树植物角果木(Ceriops tagal)和其近缘的非红树植物旁杞木(Carallia longipes)在各自正常生境条件下的转录组,通过比较我们发现红树转录组中环境胁迫响应成分,能量代谢成分,对光反应成分等显著富集,而与生长发育过程相关的组分则缺乏。通过这个研究,我们在获悉表达谱的同时得到了角果木和旁杞木大量EST序列,为这两个物种及近缘物种的群体遗传学,物种形成,以及功能基因组学研究的开展奠定了基础,同时也为Solexa测序技术在高等非模式植物中的应用提供了一个借鉴。
我们使用实时定量PCR验证了一批受盐诱导的红树功能基因,结合RACE及染色体步移技术,获得了P5CS,NHX,CDPK,CIPK,WRKY等一批基因的全长或近全长cDNA,及部分基因的5调控区序列。与对盐敏感的拟南芥同源基因比较显示,红树抗盐基因在蛋白水平并没有表现出更高效力的抗盐能力,但是在表达调控上显示了“显著”的差异。红树耐盐基因表现出更强的组织特异性,拟南芥NHX1基因在植物各个器官都比较均衡的表达,红树植物桐花树NHX1只是在叶中强烈表达,这可能与桐花树的泌盐机制密切相关,这种特化可能是红树适应盐生环境的重要方面。
红树盐诱导基因不仅是一种重要的遗传资源,而且为在分子水平检验自然选择提供了一个极好的材料,盐耐受基因的群体遗传和进化分析将为我们了解各种进化动力在红树盐适应形成过程的作用提供重要信息。首先,为衡量基因组水平桐花树的遗传多样性及遗传结构,我们采集世界范围的13个桐花树种群共计202个个体用AFLP分子标记进行了基因组扫描,结果显示桐花树具有较高的遗传多样性(P=92%,HE=0.294,HS=0.331),同时种群间存在巨大的遗传分化(GST=0.698)。在此基础上,我们选取了中国、泰国、斯里兰卡和澳大利亚的八个代表性种群,对四个受盐激显著上调的表达基因:AcP5CS、AcNHD、AcNHX2和AceIF3B进行了群体遗传和分子进化分析。四个基因表现了不同的进化模式,虽然地理隔离和群体的进化历史可以部分解释这些现象,各地的生态环境因素可能也发挥了极重要的作用。地理隔离和群体历史对于整个基因组的影响是相似的,我们检测到的不一致提示自然选择等因素在其中起了一定的作用,这需要选取更多的基因位点进一步研究。
siRNA介导的基因沉默及异染色质形成在保持基因组完整性中发挥着重要的作用,此过程中双链RNA的形成是关键,除少部分位点具有反向重复结构及转录本有重叠的基因对可以自然形成双链外,拟南芥中主要通过RDR2(RNAdependent RNA polymerase2)来完成双链RNA的合成。
用RDR2作诱饵经酵母双杂交筛选我们得到一个相互作用蛋白AtJMJ24,初步分析AtJMJ24具有RING和JmjC两个功能域。通过详实的生化实验我们证实AtJMJ24与RDR2在体内体外都有相互作用,而且在体内体外都可以泛素化RDR2,该泛素化极可能是单泛素化,而且在体内JMJ24泛素化RDR2可以稳定RDR2,我们进一步用蛋白质质谱技术确定了一个泛素化位点。同时我们还证实AtJMJ24具有H3K9me2去甲基化活性,对于沉默位点基础量转录本的产生是必需的,通过对jmj24与rdr2双突变体的分析,我们确定两者作用在同一信号通路中,JMJ24作用于RDR2的上游。通过tiling array,我们对AtJMJ24在基因组范围的靶标基因进行了扫描,结果显示AtJMJ24主要影响转座子,简单重复序列等非编码位点。综合以上结果,我们提出了一个AtJMJ24可能的作用模型。