第一部分BBD9抑制骨髓瘤细胞生存并诱导细胞凋亡目的：观察BBD9对多发性骨髓瘤细胞生存的影响及其机制。方法：MTT法检测BBD9对多种骨髓瘤细胞株及原代细胞的生长抑制作用，瑞氏染色观察细胞形态学变化，AV-PI法检测细胞凋亡，检测DNA ladder，流式细胞术检测细胞周期，western blot法检测caspase，BCL-2家族蛋白及细胞周期调控蛋白。结果：在0～4μg／ml BBD9作用下，BBD9能显著抑制四种骨髓瘤细胞株(RPMI8226、U266、MM．1S、MM．1R)的生长。随着BBD9浓度的升高，各细胞株的细胞存活率逐步降低。此外，BBD9对四种细胞株的生长抑制作用也呈时间依赖性，同一浓度下，药物作用时间越长，细胞存活率也越低。BBD9作用于RPMI8226、U266、MM．1S、MM．1R细胞24h的IC50依次是：2．30μg／ml、1．87μg／ml、2．39μg／ml、1．54μg／ml。BBD9对3例病人原代细胞也呈现剂量依赖性的生长抑制。BBD9处理骨髓瘤原代细胞24h的IC50为1．08μg／ml。用正常骨髓单个核细胞进行MTT检测发现，在0-4μg／ml BBD9也呈剂量依赖性地抑制正常骨髓单个核细胞的生长，但其对药物的敏感性低于原代细胞，24h的IC50为3．24μg／ml。形态学观察可见，BBD9处理24h后的U266细胞和RPMI8226细胞出现了典型的凋亡细胞形态：核碎裂，凋亡小体。DNA片段化检测可见经BBD9处理的RPMI8226细胞出现了典型“DNA梯子”，随着药物浓度的增加，“DNA梯子”也越明显。AV-PI法检测细胞凋亡也发现，BBD9可以诱导骨髓瘤细胞出现凋亡。0、1、2、3μg／ml BBD9处理RPMI8226细胞24h后，早期凋亡细胞比例分别为1．57±0．37％、4．79±2．47％、16．18±5．45％、42．94±13．99％；而在U266细胞，早期凋亡细胞的比例分别为2．69±1．28％、7．36±2．22％、19．67±2．83％、50．26±16．29％。BBD9还可以诱导U266细胞和RPMI8226细胞caspase-3，-8，-9及PARP剪切激活。进一步的检测可见，BBD9处理后，促凋亡蛋白Bak、Bax和Bim表达量在U266和RPMI8226细胞均有明显升高，抑凋亡蛋白Mcl-1明显下调。但是，另外两种重要的抑凋亡蛋白BCL-2和BCL-XL则变化不明显。此外，对细胞周期分析表明，BBD9使骨髓瘤细胞周期阻滞在G2／M期。0、1、2、3μg／ml BBD9处理24h后，处于G2／M期的RPMI8226细胞分别为4．49±3．79％、13．61±2．09％、41．03±2．09％、35．99±9．05％；而处于G2／M期的U266细胞分别为14．14±0．6％、19．48±2．84％、26．54±3．44％、33．62±3．0％。细胞周期调控蛋白cyclinA、cyclinB1在BBD9处理的RPMI8226细胞和U266细胞中均明显下调，而CDK1及P27无明显改变。结论：(1)BBD9能抑制多种骨髓瘤细胞株及原代细胞生长。(2)BBD9诱导骨髓瘤细胞凋亡。(3)BBD9上调促凋亡蛋白Bak、Bax和Bim，下调抑凋亡蛋白Mcl-1。(4)BBD9通过下调cyclinA、cyclinB1使细胞周期阻滞于G2／M期。第二部分BBD9诱导的凋亡伴随着FOXO3a／Bim途径激活目的：研究BBD9诱导的Bim蛋白表达上调的机制。方法：Real-time PCR检测Bim mRNA及mir-17-5p的表达，western blot分析细胞核内FOXO3a及pFOXO3a表达量，免疫荧光显微镜观察FOXO3在细胞内的分布。结果：BBD9处理U266细胞8h后，Bim mRNA拷贝数明显增加。与此同时，对BimmRNA起负调控作用的成熟体小RNA—mir-17-5p明显下调。3μg／ml BBD9处理时，mir-17-5p下降至未处理组的0．35±0．23倍。Westem blot结果显示，BBD9处理的U266细胞核内Bim基因转录因子FOXO3a的表达量较未处理的U266细胞明显升高。与此相反，核内pFOXO3a蛋白量随着BBD9浓度的增加而减少。免疫荧光显微镜下可以看到：在BBD9处理前，U266细胞胞核内FOXO3a表达较低，胞浆内FOXO3a表达相对较高；而在2μg／ml BBD9处理24h后，U266细胞胞核内FOXO3a的荧光较强，而胞浆中FOXO3a则较弱。同样地，在BBD9处理前，RPMI8226细胞胞核内FOXO3a荧光较弱，胞浆内FOXO3a荧光则相对更强；而在2μg／mlBBD9处理24h后，RPMI8226细胞胞核内FOXO3a的荧光较强，而胞浆中FOXO3a则较弱。结论：(1)BBD9通过提高胞核内FOXO3a的表达量，促进Bim基因转录，增加BimmRNA拷贝数，从而导致Bim蛋白表达上调。(2)BBD9还通过下调mir-17-5p，减少Bim mRNA降解或对Bim mRNA翻译的抑制，从而使Bim蛋白表达上调。第三部分BBD9抑制IL-6信号传导途径的激活目的：通过观察IL-6信号传导途径中参与信号转导的各种分子的改变，进一步阐明BBD9诱导的骨髓瘤细胞凋亡的分子机制。方法：MTT检测外源性IL-6对BBD9诱导的U266细胞生长抑制的影响，ELISA检测U266细胞培养上清IL-6水平，流式细胞术检测细胞膜上IL-6R的表达量，Real-time PCR检测细胞IL-6mRNA及IL-6R mRNA表达量，western blot检测细胞内各种激酶的磷酸化水平。结果：外源性IL-6减弱BBD9诱导的生长抑制。U266细胞在1μg／ml BBD9作用24h后，其生存率为88．83％，加用150ng／ml IL-6后，其生存率显著升高至104．83％；2μg／ml BBD9作用24h后，U266细胞的生存率仅有43．03％，而加用IL-6后，其生存率显著升高至55．93％。ELISA法检测U266细胞培养上清IL-6水平，发现BBD9能减少自分泌的IL-6。0、1、2、3μg／ml BBD9处理24h后，U266细胞培养上清中IL-6水平分别为33．49±7．92pg／ml、10．34±5．83pg／ml、13．59±7．22pg／ml、10．78±6．67pg／ml。此外，细胞膜上IL-6R的表达量也略有下降。1、2、3μg／ml BBD9处理8h，IL-6mRNA表达量分别是未处理组的0．9、3、2．7倍，而IL-6R mRNA无明显变化。BBD9处理后，U266细胞内IL-6信号传导途径中两个重要的激酶STAT3及AKT磷酸化水平均明显下调，而其总STAT3及总AKT均无改变。结论：(1)BBD9抑制骨髓瘤细胞自分泌IL-6及细胞膜IL-6R的合成，但并不在mRNA水平抑制二者的表达。(2)BBD9使骨髓瘤IL-6信号传导途径的STAT3和PI3K／AKT途径受抑。(3)IL-6信号传导途径受阻是BBD9诱导骨髓瘤细胞凋亡的一个重要机制。第四部分BBD9增加多药耐药K562／A02细胞对阿霉素的敏感性及其机制目的：研究BBD9能否逆转p-gp介导的急性白血病多药耐药及其机制。方法：MTT检测细胞对阿霉素的耐药性，流式细胞术检测细胞的凋亡率、测定细胞内阿霉素浓度及检测细胞膜表面p-gp表达量的变化，Real-time PCR检测细胞内mdr-1 mRNA表达。结果：阿霉素作用于K562／A02细胞24h的IC50为7．57μg／ml，作用于K562细胞24h的IC50为0．651μg／ml，K562／A02细胞耐药指数为11．65。2μg／ml阿霉素与1μg／mlBBD9单独或联合处理K562／A02细胞24h，结果发现：2μg／ml阿霉素处理组细胞凋亡率为6．04±2．28％，1μg／ml BBD9处理组细胞凋亡率为8．21±5．74％，对照组细胞凋亡率为6．59±2．56％。然而，2μg／ml阿霉素与1μg／ml BBD9联合处理组，细胞凋亡率明显升高至35．93±1．87％，与对照组相比差异具有显著统计学意义。但是，0．4μg／ml阿霉素与1μg／ml BBD9单独或联合处理K562细胞24h，结果显示：对照组凋亡率为1．77±0．58％，单用BBD9组凋亡率为3．52±2．0％，单用阿霉素组为11．77±8．44％，而BBD9联合阿霉素组的凋亡率为2．93±0．48％，各组之间差异无统计学意义。检测细胞内阿霉素浓度显示，BBD9处理1h，能使阿霉素阳性K562／A02细胞由单用阿霉素时的8．88±12．98％升高至87．82±12．03％；BBD9处理24h，能使K562／A02细胞阿霉素的平均荧光强度由单用阿霉素时的39．78±3．64％升高至54．4±5．63％。进一步的结果显示，BBD9并不能减少mdr-1 mRNA的表达，也不能影响细胞膜上p-gp蛋白的表达。结论：(1)BBD9能增加K562／A02细胞对阿霉素的敏感性，而不能增加K562细胞对阿霉素的敏感性。(2)BBD9通过提高p-gp高表达的K562／A02细胞内阿霉素浓度使得细胞对阿霉素的敏感性增加。(3)BBD9对化疗药物的增敏作用并不涉及p-gP蛋白数量的改变，可能是通过抑制p-gP的泵功能达到增敏作用的。总结：BBD9具有抑制多发性骨髓瘤细胞株及原代细胞生长的作用。这种生长抑制作用是与细胞凋亡有关的。在BBD9诱导的骨髓瘤细胞凋亡过程中，促凋亡蛋白Bim、Bax及Bak上调，而抑凋亡蛋白Mcl-1则下调。BBD9能通过下调cyclinA、cyclinB1使细胞周期阻滞于G2／M期。此外，BBD9还能增加骨髓瘤细胞核内FOXO3的表达量，抑制mir-17-5p，最终导致Bim蛋白表达增加。BBD9能抑制U266细胞IL-6和IL-6R合成，并抑制IL-6信号传导途径的两个重要途径：STAT3和PI3K／AKT途径。说明IL-6信号传导途径受阻是BBD9诱导的骨髓瘤细胞凋亡的一个重要机制。此外，我们的研究还发现BBD9能增加K562／A02细胞对阿霉素的敏感性，而不能增加K562细胞对阿霉素的敏感性。进一步研究表明，BBD9通过提高K562／A02细胞内阿霉素浓度实现逆转细胞对阿霉素的耐药。由于BBD9既不能降低mdr-1 mRNA表达量，也不能降低p-gP的蛋白表达量，提示BBD9可能是通过抑制p-gP的泵功能达到逆转耐药的作用的。