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鸭可作为活化石用于对鸟类进化的研究,和鸡一样有着很多的优势,可作为模式动物对重要数量性状和疾病进行研究。鸭结构基因组学是功能基因组和鸟类比较基因组研究的基础,为了能够更多的了解鸭的基因组结构,本实验主要通过构建鸭细菌人工染色体文库,然后应用BAC-FISH技术对连锁群进行物理定位。
抽取一只北京母鸭静脉血,用于制备大分子量基因组DNA。制备好的基因组经过HindHI部分酶切后,二次脉冲电泳分离片段。电洗脱回收200kb~500kb范围的片段,然后与plndigo-5BAC载体连接,转化DHl0B感受态细胞,经过培养,挑取和保存白色的单克隆。
文库共有84,480个单克隆(保存在22个超级池,每个超级池由10个384孔板组成)。随机挑选了234个克隆进行插入片段大小的估计,平均为117.94kb,其中空克隆的比例为1.28%,表明文库的覆盖率为9.84倍。同时,用位于不同染色体上的14个微卫星标记和8个功能基因进行文库PCR筛选,所有这些标记和基因都得到了阳性克隆,克隆数从2到20不等,平均为9.82。说明文库具有良好的覆盖率,并且与前面鉴定结果一致。从文库中筛选任意目的DNA序列的概率为99.99%。
为了把鸭遗传图谱和物理图谱结合起来,本实验通过选择位于6条不同连锁群上的8个微卫星标记AMU56,AMU60,AMU68,AMU173,CAUD027,CAUD052,CAUD065,CAUD088,对已构建好的鸭子BAC文库进行筛选,得到的阳性克隆作为探针,应用.FISH手段分别将其定位到不同的鸭子中期染色体分裂相上。
微卫星标记CAUD027被FISH定位到鸭l号染色体上。根据连锁群CAU1上已定位的别的标记,就可对1号连锁群CAU1在染色体上进行排列定向。另外,根据国际上鸡的标准G带核型图,将该标记具体定位到了1号染色体短臂1p21-23区域。
连锁群CAU2上的标~ECAtUD065被FISH定位到了鸭2号染色体短臂区2p22-24,同样也可用于对CAU2在染色体上进行定向。
位于连锁群CAU19上的两个标记AMU60,AMU173则被定位到了鸭5号染色体5q17处,该连锁群是首次被定位。由于该连锁群只有两个标记构成,因此要对该区域/染色体进行更进一步深入和准确的研究,最大的可能就是要筛选得到越来越多的微卫星标记,提高连锁群的标记密度。
本研究所用的其它标记,CAU9连锁群上的AMt168和CAUD088,CAU10上的AMU56,CAU4上的CAUD052均被定位到了鸭小染色体上。目前,国际上尚没有区分禽类小染色体的标准,因此无法区分它们在几号染色体,尽管AMU68和CAUD088位于同一条连锁群上。
BAC-FISH的结合在染色体分析中发挥了很多的优势。然而,鸭基因图谱的密度还非常有限,相信很快会有越来越多的分子标记和鸭功能基因被定位,并且会在功能基因组水平上进行分析研究。此外,随着鸭高密度物理图谱的构建以及比较基因组学的分析,将会对鸟类基因组进化机制有更深入的了解。