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研究背景前列腺癌(prostate cancer,PCa)是全球男性人群中最常见的恶性肿瘤之一,发病率位居第二位,死亡率居于第六位,严重威胁着老年男性的健康。虽然目前中国的前列腺癌发病率低于欧美国家,但是其增长速度非常迅速,预计至2020年发病率接近欧美发达国家平均水平,达到40/10万男性人口。由于前列腺癌症状隐蔽,国内患者诊断前列腺癌时分期较晚,超过50%的患者确诊时已发生局部进展或转移,与美国确诊时超过80%以上都是局部前列腺癌相比差距巨大,除了PSA筛查尚未在国内大规模普及的原因外,可能存在的种族差异也是重要的原因。美国国家癌症中心SEER(Surveillance Epidemiology and End Results,SEER)数据库2006-2012年的资料显示,局限性前列腺癌的5年生存率达到100%,而转移性前列腺癌的5年生存率仅为29.3%。因此,探索前列腺癌早期诊断标志物对于我国前列腺癌诊疗和研究意义重大。人类基因组计划研究成果表明,仅有约19000个基因编码蛋白质,占整个基因组的1-2%,剩下98-99%都是“暗物质”非编码序列。随着下一代测序技术(Next generation sequencing,NGS)的成熟,最初被认为转录噪声的长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)逐渐展现出其重要的作用。正是这些lncRNA才使得基因组调控异常复杂,充分发挥生物学功能。lncRNA是转录本长度超过200个碱基的RNA,不编码蛋白质或只编码较短的多肽——微肽,具有广泛的组织表达谱,较强的组织和细胞表达特异性,lncRNA可在表观遗传、转录和转录后水平等多个层面调控基因表达,调节蛋白基因功能。越来越多的研究表明lncRNA可通过多项机制调节基因功能,从而影响肿瘤细胞的生物学功能,发挥促进或抑制肿瘤的作用。同时,也有大量的lncRNA用于前列腺癌的早期诊断和分子分型。研究目的:本课题的主要研究目的是基于前列腺癌组织的二代测序数据筛选出肿瘤相关长链非编码RNA,并研究其在调节前列腺癌增殖和侵袭迁移中的作用机制,探寻前列腺癌的治疗靶点,寻找前列腺癌微创体液诊断的生物标志物,为前列腺癌的个体化诊治提供参考。从而为研发新型的前列腺癌靶向药物、优化临床治疗方案提供可靠的理论依据。研究方法:本课题采用NGS技术对65例中国人前列腺癌组织样本进行测序,分析RNA-seq数据,筛选显著差异表达的肿瘤相关lncRNA分子。对于筛选出来的lncRNA分子进行组织学和细胞学验证,利用生物信息学方法验证lncAPP的编码能力。qRT-PCR检测长海医院单中心291例拟行前列腺穿刺患者的前列腺按摩后尿渣中lncAPP表达水平,分析其是否能作为早期诊断指标有效区分前列腺癌患者与良性前列腺增生患者,和作为分子分型标志物区分低级别前列腺癌与高级别前列腺癌。应用RNA荧光原位组织杂交技术与核质分离技术明确lncAPP在前列腺癌肿瘤细胞系中的功能定位。应用干扰lncAPP表达的siRNA和外源性表达lncAPP的质粒作用于前列腺癌肿瘤细胞系,研究其对于维持肿瘤细胞生长能力包括肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭功能的影响。应用慢病毒介导的稳定外源性表达lncAPP细胞系建立动物体内皮下荷瘤模型,应用瘤内持续注射siRNA介导的干扰lncAPP表达的皮下荷瘤模型,研究lncAPP对于维持肿瘤生长能力的影响。应用尾静脉注射稳转过表达lncAPP细胞系构建裸鼠转移模型,研究lncAPP对于肿瘤细胞转移能力的影响。应用生物信息学分析预测可能与lncAPP结合的miRNA及其结合位点,构建lncAPP-MS2-12X质粒通过RNA免疫沉淀(RIP)实验验证lncAPP能够与miRNA结合,构建野生型和突变型荧光素酶报告基因明确lncAPP与miRNA的结合位点。探索miRNA靶向的mRNA分子,验证lncAPP通过与miRNA竞争性结合调节下游关键分子,从而发挥维持肿瘤细胞生长的能力。运用micro-array芯片分析外源性高表达和敲减lncAPP的肿瘤细胞系的表达谱,筛选出差异表达的重要基因和信号通路。研究结果:分析65对中国人前列腺癌组织的RNA-seq数据发现存在显著差异的肿瘤相关lncRNA表达谱,按照临床分期、Gleason评分及进展转移三个标准筛选出lncAPP。前列腺癌患者尿渣和血浆中可检测到lncAPP,且前列腺癌患者体液中的表达水平高于良性前列腺增生患者。按摩后尿液lncAPP可以作为早期诊断分子标志物,能够区分穿刺阳性和穿刺阴性患者,且能区分高级别和低级别前列腺癌。通过外源性过表达和RNAi敲减的功能实验,证实lncAPP能够维持前列腺癌肿瘤细胞的增殖能力,促进肿瘤细胞迁移和侵袭。动物皮下荷瘤模型证实lncAPP能够维持前列腺癌肿瘤细胞的增殖能力,且能够促进肿瘤的转移。尾静脉注射稳转细胞系的体内转移模型,证实lncAPP能够促进肿瘤细胞的转移能力。应用miRDB和Target Scan数据库分析预测可能与lncAPP结合的miRNA,qRT-PCR检测外源性表达和敲减lncAPP的肿瘤细胞系中miRNA表达水平。运用MS2-RIP实验验证lncAPP能够与miR218/646结合,构建包含lncAPP与miR218/646结合位点及结合位点突变的荧光素酶质粒,明确其具体结合位点。证实lncAPP通过结合miR218/646,调节miR218/646靶向的下游mRNA发挥调节作用。Micro-array芯片分析外源性高表达和敲减lncAPP的肿瘤细胞系的转录谱,发现显著差异表达的基因和重要信号通路。研究结论:本研究基于中国人前列腺癌组织的RNA-seq测序数据,筛选出肿瘤相关的lncRNA分子,证实lncAPP能够作为早期诊断前列腺癌和区分高级别前列腺癌的分子标志物。体外和体内实验证实lncAPP可维持前列腺癌肿瘤细胞增殖和迁移侵袭能力。机制实验证明lncAPP结合miR218/646,阻断miR218/646对下游关键分子的抑制作用。lncAPP不但能作为早期诊断标志物应用于前列腺癌的早期诊断和分子分型,提高前列腺穿刺的阳性率,减少过度穿刺带来的痛苦和经济负担有着重要的转化医学意义;还可作为肿瘤治疗和抗转移的新靶点,从而为研发新型药物、优化临床诊治方案提供可靠的理论依据。