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多不饱和脂肪酸是重要的生理活性物质,γ-亚麻酸(Gamma-Linolenic Acid,GLA)作为人体必需多不饱和脂肪酸的一种,来源十分贫乏,远远不能够满足广大市场的需求;鉴于GLA具有调节血脂、营养强化、抑制溃疡、增强胰岛素、抗肿瘤、减肥等一系列生物学功能,因此开发高产GLA的基因工程菌株具有非常重要的意义。油脂酵母生产油脂具有成本低、周期短、受环境影响小、油脂和亚油酸含量高等优势,用其作为油脂积累相关基因表达的合适宿主,目前尚未见相关报道。本研究将以本实验室已经克隆的刺孢小克银汉霉(Cunninghamella echinulata MAIN6)和匍枝根霉(Rhizopus stolonifer YF6)的△6-脂肪酸去饱和酶基因为材料,一方面构建毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae INVscI)去饱和酶基因表达载体,验证去饱和酶基因的功能是否完整;另一方面以高含油量的酵母菌株作为宿主,构建橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae 1714)和发酵性丝孢酵母(Trichosporon fermentans 20243)的整合型表达载体,建立橘林油脂酵母和发酵性丝孢酵母的转化系统,为下一步开展脂肪酸去饱和酶基因的表达提供技术平台。毕赤酵母表达△6-脂肪酸去饱和酶基因的结果如下:刺孢小克银汉霉△6-脂肪酸去饱和酶基因实现了诱导表达,表达量约为油脂含量的3.0%,证明了刺孢小克银汉霉△6-脂肪酸去饱和酶基因是具有完整功能的基因,其表达量不高可能由于毕赤酵母亚油酸含量低引起,或者是发酵条件不适合GLA的积累,需要进一步优化。而通过对匍枝根霉△6-脂肪酸去饱和酶基因的重组毕赤酵母菌株气相色谱分析,没有检测到GLA的存在,其原因可能是由于基因在克隆及载体构建过程中本身发生了定点突变造成了蛋白不能够正确的表达,或者诱导表达时发酵条件不理想且收集的菌体过少造成了GLA峰值的不理想。酿酒酵母表达△6-脂肪酸去饱和酶基因的结果显示:分别装载有刺孢小克银汉霉和匍枝根霉△6-脂肪酸去饱和酶基因的整合型表达载体和非整合型表达载体转化酵母后,测定脂肪酸时都没有检测到GLA的存在,其原因与酿酒不适合30kD以上蛋白的正确折叠、不具有亚油酸和只能在营养成分不丰富的缺陷型培养基中生长有关。油脂酵母表达载体构建及转化实验结果:以来自pINA1296的杂合启动子hp4d为启动元件,以潮霉素基因(HYG)为抗性筛选标记,以绿色荧光蛋白酶基因(GFP)为报告基因,构建了橘林油脂酵母表达载体pLK-rhPHG,转化酵母实验表明杂合启动子成功的启动了潮霉素基因和绿色荧光蛋白基因在橘林油脂酵母中的表达。以丝孢酵母21148磷酸甘油酯激酶(PGK)基因的启动子作为启动元件,以潮霉素和荧光蛋白分别为选择性标记和报告基因构建了发酵性丝孢酵母表达载体pTF-rPHG,转化酵母实验表明PGK启动子成功的启动了潮霉素基因的表达,但由于发酵性丝孢酵母本身有少量绿色荧光产生,因此绿色荧光蛋白作为报告基因检测(PGK)启动子的活性效果不理想。