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子宫内膜癌是女性生殖系统的三大恶性肿瘤之一，近年来其发病率呈逐步上升趋势，已成为威胁女性生存质量的一个重要原因。实验研究和临床资料证明雌激素及其代谢中间产物与子宫内膜癌的发生有关。4-羟基雌二醇(4-OHE2)由CYP1B1羟化酶从雌二醇代谢而来，其致癌效应在雌激素诱发癌变过程中占主导地位。
儿茶酚—O—甲基转移酶(catechol—O—methyltransferase，COMT)可以催化有致癌作用的4-OHE2甲基化，生成无致癌效应的代谢产物排出体外。如果甲基化过程不完全，4-OHE2通过诱导DNA损伤导致癌症发生。COMT基因具有基因多态性，在其第4号外显子上存在1个G与A的置换点突变，使膜结合型COMT编码的158位缬氨酸(Val)被甲硫氨酸(Met)取代，导致COMT的活性改变。COMT Met/Met基因编码的酶活性比COMTVal/Val基因编码的酶活性低3～4倍。
自2004年起，开始有研究报道COMT基因多态性与子宫内膜癌发生风险之间的关系，但目前尚未取得一致的结论。Sasaki等认为选择性灭活COMT，促进子宫内膜癌的发生。我们之前的研究显示：COMT Met基因型可能增加患子宫内膜癌的风险。而Zimarina等研究显示COMT158位等位基因多态性并不增加子宫内膜癌的发病风险。
综上所述，雌激素代谢产物4-OHE2的致癌效应在雌激素诱发癌变作用中占主导地位，COMT能将有致癌作用的4-OHE2甲基化为无致癌效应的代谢产物排出体外。但COMT基因与子宫内膜癌发病风险之间的关系目前尚未确定。我们旨在通过本研究采用RNAi方法阻断COMT基因表达，探讨COMT酶活性的改变及其对子宫内膜癌细胞增殖的影响。了解COMT基因与子宫内膜癌发生风险之间的关系。
材料与方法：
选择雌激素受体阳性的子宫内膜癌RL95_2细胞，针对目的基因COMT设计4对小干扰RNA： siCOMT—96，siCOMT—268，siCOMT—303，siCOMT—731，及阴性对照siRNA，通过脂质体将其转染入RL952细胞中。
实验内容包括：
1.检测RL95_2细胞中COMT基因表达。
2.检测COMT siRNA对RL952细胞的转染率。
3.Real Time PCR、Western Blot分别检测COMT基因沉默后其mRNA和蛋白表达水平的变化，筛选出沉默效果最好的RNA干扰序列。
4.液相色谱—质谱(选择离子监测)法，MTT法分别检测COMT基因沉默后RL95-2细胞中4-OHE2水平和RL95-2细胞增殖活性的改变。
结果：
1.Real Time PCR，Western blot结果显示RL95-2细胞中有COMT基因mRNA和蛋白表达。
2.荧光显微镜观察结果显示脂质体能有效地将COMTsiRNA转染入RL95-2细胞中。其转染率达80％以上。
3.Real Time PCR，Western blot结果显示本实验中设计的四对COMTsiRNA均能降低RL95-2细胞中COMTmRNA和蛋白表达。但程度不一，均以COMTsiRNA—731的抑制效果最显著。COMTmRNA相对表达量于转染COMTsiRNA—731后24h(0.249±0.017)，48h(0.44±0.064)较脂质体对照组24h(1)，48h(1)显著降低，24h和48h分别下降76.6％和57.1％，差异有显著性(P<0.05)。COMT蛋白表达于转染COMTsiRNA—731后48h(0.154±0.009)，72h(0.515±0.045)较脂质体对照组48h(0.701±0.048)，72h(0.835±0.073)显著降低，48h和72h分别下降78.08％和38.3％，差异有显著性(P<0.05)。
4.液相色谱—质谱检测结果显示RL95-2细胞中4-OHE2水平于转染COMTsiRNA—731添加E2后12h(0.205±0.001)，24h(0.372±0.002)较未转染组间12h(0.148±0.004)，24h(0.241±0.001)显著增高，差异有显著性(P<0.05)。MTT结果显示RL95-2细胞增殖活性于转染COMTsiRNA—731后72h(0.293±0.007)，96h(0.476±0.007)，120h(0.585±0.015)较未转染组间72h(0.153±0.002)，96h(0.276±0.005)，120h(0.562±0.011)显著增强，差异有显著性(P<0.05)。
结论：
1.本研究筛选出COMTsiRNA—731沉默RL95-2子宫内膜癌细胞的COMT基因效果最好，该方法可作为特异性阻断COMT基因表达、评价其功能的良好手段。
2.沉默COMT基因后，4-OHE2在细胞内蓄积，子宫内膜癌RL95-2细胞增殖活性明显增强，可能揭示了子宫内膜癌发生的基因机制。