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背景与目的:以问号钩端螺旋体为代表的致病性钩端螺旋体广泛分布于热带、亚热带和温带地区,引起的人兽共患病称为钩端螺旋体病,简称钩体病。该病是我国重点防控的传染病之一,目前常用诊断钩体病的方法和应用的疫苗存在各自的缺点。近年的研究表明,外膜蛋白是钩体外膜中的重要组成部分,其中多种组分具有致病性和免疫原性。本研究为提高血清学检测的敏感性和特异性,克隆、表达LipL21, Loa22,LipL32和LigACon4-8,并以这4种重组蛋白为抗原,建立检测马和狗血清中相应抗体的ELISA和狗血清中相应抗体的LUMINEX法,为研制诊断钩体病的新血清学检测方法奠定实验基础。应用分子生物学方法,构建CTB-OmpL1重组乳酸菌口服疫苗,并利用仓鼠模型评价其免疫保护作用,为研制新型疫苗奠定基础。研究内容与方法:1.采用PCR方法,从钩端螺旋体基因组DNA中分别扩增LipL21,Loa22, LipL32和LigACon4-8基因片段,构建原核表达载体LipL21-PET28/Rosetta, Loa22-PET28/Rosetta, LipL32-PGEX4T2/BL21, LigACon4-8–PET28/Rosetta,大量诱导表达重组菌,运用Ni+NTA及正负离子吸咐柱纯化获得重组蛋白,用Wester blot鉴定。2.以重组蛋白LipL21, Loa22, LipL32和LigACon4-8为抗原,建立检测马血清和狗血清中相应抗体的ELISA,用建立的ELISA检测大量临床马血清和狗血清并与传统MAT比较,评价其诊断价值。3.以重组蛋白LipL21, Loa22, LipL32和LigACon4-8为抗原,建立检测狗血清中相应抗体的Luminex法,检测大量临床狗血清中相应抗体,并与传统MAT比较,评价其诊断价值。4.用基因工程技术,克隆、表达钩端螺旋体重组蛋白CTB-OmpL1,转入乳酸菌中制备CTB-OmpL1口服疫苗;制备仓鼠钩体感染动物模型,通过该模型评价该口服疫苗的免疫保护作用。结果:1.成功构建了重组表达质粒LipL21-PET28/Rosetta, Loa22-PET28/Rosetta, LipL32-PGEX4T2/BL21, LigACon4-8-PET28/Rosetta,双酶切鉴定基因完整,基因测序结果表明与Genebank基因序列基本一致,表达重组菌后获得2-5mg/ml浓度,纯度达90%以上的高浓度的纯化蛋白。Wester blot结果显示重组蛋白能与感染钩体的马和狗血清发生反应。2.用LipL21, Loa22, LipL32和LigACon4-8重组蛋白为抗原建立的ELISA检测130例MAT阴性和176例MAT阳性马血清,对马血清检测结果,其敏感性分别可达84.66%,77.84%,77.84%,82.39%,特异性达83.85%,92.31%,86.15%,86.15%。3.用LipL21, Loa22, LipL32和LigACon4-8重组蛋白为抗原与203例MAT阳性,102例MAT阴性狗血清作ELISA检测,其敏感性分别可达99.5%,89.7%,92.6%,97.5%,特异性达84.3%,81.4%,84.3%,84.3%。4.用LipL21, Loa22, LipL32和LigACon4-8重组蛋白为抗原建立了检测狗血清中相应抗体的Luminex法,检测了203例MAT阳性,20例MAT阴性狗血清,其敏感性分别可达89.66%,75.86%,82.27%,78.33%,特异性达85.0%,80.0%,90.0%,80.0%。5.构建了重组CTB-OmpL1乳酸菌口服疫苗,建立了钩体感染的仓鼠动物模型;口服疫苗免疫仓鼠后可产生较好的免疫保护较果,攻毒后免疫仓鼠存活率可达87.5%。结论:成功表达LipL21, Loa22, LipL32和LigACon4-8,获得高纯度的重组蛋白,均具有良好的抗原性。成功建立了检测马和狗血清中钩体抗体的ELISA,成功建立了检测狗血清中钩体抗体的Luminex法,经检测大量马与狗的临床血清标本,具有较高的敏感性和特异性。钩体重组CTB-OmpL1乳酸菌口服疫苗在仓鼠模型中表现出较好的免疫保护效果。为研制诊断钩体病的新血清学检测方法奠定实验基础。成功构建了CTB-OmpL1重组乳酸菌口服疫苗,经仓鼠模型评价具有较好的免疫保护作用,为研制新型疫苗奠定了基础。